Phát hiện các gene Blaoxa ở Acinetobacter Baumannii bằng phương pháp Multiplex pcr‐Elisa

Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 458 PHÁT HIỆN CÁC GENE BLAOXA Ở ACINETOBACTER BAUMANNII  BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR‐ELISA  Nguyễn Sĩ Tuấn*, Lưu Trần Linh Đa*, Lê Duy Nhất*, Hứa Mỹ Ngọc*, Nguyễn Ngọc Thanh*,   Phạm Thị Thanh Thủy*, Phạm Văn Dũng*, Nguyễn Thúy Hương**  TÓM TẮT  Đặt vấn  đề: Acinetobacter baumannii (AB) kháng đa kháng sinh bằng nhiều cơ chế, bao gồm giảm tính  thấm qua màng, biểu hiện quá mức bơm  thải kháng  sinh và  sản xuất carbapenemase. Năm 2013, AB kháng  carbapenem bùng phát mạnh ở nhiều bệnh viện. Tính kháng này có thể do sự sản xuất các carbapenemase, trong  đó các oxacillinase thủy phân carbapenem thuộc lớp D (OXA‐23, OXA‐40, OXA‐58 và OXA‐51) được công bố  phổ biến nhất ở Châu Á – Thái Bình Dương.   Mục tiêu: Phát hiện các gene blaOXA lưu hành trong các chủng AB ở bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng  Nai năm 2013.  Phương pháp nghiên cứu: Multiplex PCR – ELISA được tiến hành để phát hiện các blaOXA mã hoá các  oxacillinase thuỷ phân carbapenem ở AB và sau đó, kết quả được kiểm tra bằng multiplex PCR truyền thống.  Kết quả: Trong 66 chủng AB thử nghiệm, có 83,3% kiểu gene kháng carbapenem là blaOXA‐23 và 16,67%  blaOXA‐58. Có tới 97% các chủng AB mang gene blaOXA‐51.  Kết luận: Cần tiến hành cách ly các bệnh nhân nhiễm trùng do AB có lưu hành các blaOXA, đặc biệt là các  gene nằm trên plasmid, nhằm ngăn ngừa sự phát tán gene kháng thuốc.  Từ khóa: Acinetobacter baumannii, carbapenem, carbapenemase,blaOXA‐23, blaOXA‐51, blaOXA‐58.  ABSTRACT  DETECT BlaOXA GENES OF ACINETOBACTER BAUMANNII BY MULTIPLEX PCR – ELISA  METHOD  Nguyen Si Tuan, Luu Tran Linh Da, Le Duy Nhat, Hua My Ngoc, Nguyen Ngoc Thanh,   Pham Thi Thanh Thuy, Pham Van Dung, Nguyen Thuy Huong   * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 ‐ Supplement of No 6‐ 2014: 458 – 462  Background:  Acinetobacter  baumannii  (AB)  multiple  antibiotic  resistance  by  various  mechanisms,  including decreased membrane permeability, antibiotic pump overexpression and carbapenemase production. In  2013, outbreak of carbapenem which are resistant to AB occured in many hospitals. This resistance may be due to  the production of carbapenemase, in which the hydrolysis oxacillinase carbapenem class D (OXA ‐ 23, OXA ‐ 40,  OXA ‐ 58 and OXA ‐ 51) was documented most in Asian Pacific Ocean.  Objectives: To detect the gene blaOXA in AB strains accuired at Thong Nha‐ Dong Nai General Hospital in 2013.  Methods: Multiplex PCR ‐ ELISA was performed to detect blaOXA encoded oxacillinase in AB and then, the  results were confirmed by multiplex PCR.  Result: In 66 AB strains tested, 83.3% genotypes resisted to carbapenem was blaOXA‐23 and 16.67% blaOXA‐58.  Up to 97% of the AB strain was carrying blaOXA‐51 gene.  Conclusion: It is necessary to isolate patients infected AB carrying the blaOXA, especially the genes located on  plasmid in order to prevent the spread of resistance genes.  *Bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng Nai   **ĐH Bách Khoa TP.HCM – Đại học Quốc gia TP.HCM  Tác giả liên lạc: Ths. Nguyễn Sĩ Tuấn   ĐT: 0919563 323  Email: nsituan@gmail.com  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  459 Key words: Acinetobacter baumannii, carbapenem, carbapenemase,blaOXA‐23, blaOXA‐51, blaOXA‐58.  ĐẶT VẤN ĐỀ  Trong suốt thế kỷ trước, sự bùng phát các vụ  dịch Acinetobacter baumannii đa kháng thuốc gây  nhiễm khuẩn bệnh viện, đặc biệt ở những bệnh  nhân suy giảm miễn dịch  trong các đơn vị Hồi  sức Cấp cứu (ICU), đã được ghi nhận ở khắp các  vùng  địa  lý  khác  nhau  trên  toàn  thế  giới(1,10).  Những nhiễm  trùng này bao gồm nhiễm  trùng  huyết, nhiễm trùng vết mổ, viêm màng não thứ  cấp, nhiễm trùng đường niệu và viêm phổi liên  quan  thở máy(1,10). Tuy nhiên, sự phát  triển gần  đây  của  các  chủng  Acinetobacter  baumannii  sản  xuất  Carbapenemase  lớp  D  (chủ  yếu  là  oxacillinase),  là mối quan  tâm  lớn nhất  đối với  cộng  đồng  khoa  học  quốc  tế,  kể  từ  khi  Carbapenem  được  sử  dụng  thường  xuyên  để  điều trị nhiễm các chủng Acinetobacter baumannii  đa kháng kháng sinh(2,8). Vì những lý do này, đề  nghị cần thiết phải có một chương trình giám sát  trong đó bao gồm theo dõi sự kháng kháng sinh  và các nhiễm trùng mắc phải tại ICU (là gì?), với  việc  sử  dụng  các  phương  pháp  nhanh  chóng,  hiệu  quả  và  đáng  tin  cậy.  Multiplex  PCR  –  ELISA  là một phương pháp chẩn đoán mới để  trực  tiếp  phát  hiện  các  gene  mã  hóa  OXA  –  carbapenemase trong các bệnh phẩm lâm sàng.   Mục tiêu nghiên cứu  Xác định tỷ lệ các nhóm gene blaOXA lưu hành  ở Acinetobacter baumannii  tại bệnh viện Đa khoa  Thống Nhất, Đồng Nai năm 2013 bằng multiplex  PCR‐ELISA.  Xác  định  lại  kết  quả  bằng  phương  pháp  multiplex PCR.  ĐỐI TƯỢNG ‐ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU  Bệnh phẩm lâm sàng và chủng vi khuẩn  66 mẫu bệnh phẩm, bao gồm: 4 ca cấy máu  dương  tính,  6  ca  cấy mủ  vết  thương,  2  ca  cấy  nước tiểu và 54 ca cấy đàm, được thu thập trong  năm  2013  tại Bệnh  viện  Đa  khoa Thống Nhất,  Đồng Nai. Các bệnh phẩm được phân  lập  trên  môi trường MacConkey (MC). Định danh được  tiến  hành  bằng  bộ  định  danh  API  20NE,  Biomerieux, Pháp.  Kiểm tra nhạy cảm kháng sinh  Các  chủng  Acinetobacter  baumannii  thuần  được  thử  nghiệm  nhạy  cảm  kháng  sinh  bằng  phương  pháp Kirby‐Bauer  với  đĩa  kháng  sinh  của  4  nhóm:  aminoglycoside,  β‐lactam  (Imipenem  và  Meropenem),  quinolon,  và  polymycine  (colistin)  của  hãng  Biomerieux,  Pháp. Các  chủng kháng  carbapenem  được  tiến  hành thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC)  của  imipenem  và  meropenem  bằng  phương  pháp E‐TEST, Biomerieux, Pháp.  Tách chiết DNA và blaOXA PCR  Các khuẩn lạc đơn – thuần khiết (một khuẩn  lạc) được huyền phù trong 500 μl multiplex lysis  buffer.  Lysis  buffer  được  ủ  10  phút  trong  thermoblock ở 990C.Sau đó  ly tâm 1000 vòng/ 2  phút, hút 5  μl dịch nổi  để  tiến hành PCR. Các  gene mã  hóa  oxacillinase  được  xác  định  bằng  cách  sử  dụng  kỹ  thuật multiplex  PCR  với  các  mồi đặc hiệu cho blaOXA‐23, blaOXA‐40, blaOXA‐51, blaOXA‐ 58  (OXA‐23F:  5’GATCGGATTGGAGAACCAGA3’; OXA‐23R:  5’–ATTTCTGACCGCATTTCCAT–3’;  OXA‐40F:  5’– GGAATTCCATGAAAAAATTTATACTTCC–3’;  OXA‐40R:  5’– CIIIATCCCGTTAAATGATTCCAAGAIIIICTA GCG  –  3’;  OXA‐51F:  5’  –  TAATGCTTTGATCGGCCTTG–3’;  OXA‐51R:  5’–TGGATTGCACTTCATCTTGG–3’; OXA‐58F:  5’–AAGTATTGGGGCTTGTGCTG–3’;  OXA‐ 58R: 5’–CCCCTCTGCGCTCTACATAC–3’). Mỗi  phản ứng multiplex PCR gồm 5 μl dịch nổi/5 μl  chứng âm, 1 μl dung dịch Nucleotide, 2 μl dung  dịch  mồi,  5  μl  PCR  buffer  10x,  0.2  μl  DNA  polymerase 1U, thêm H2O cất 2 lần cho đủ 50 μl.  PCR – ELISA  Sản  phẩm  PCR  được  lai  đặc  hiệu  với  các  oligonucleotide trong hệ thống ELISA.  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 460 Hình 1. Lưu đồ PCR‐ELISA phát hiện oxacillinase ở Acinetobacter baumannii  Thống kê, phân tích số liệu  Nghiên  cứu  được  tiến  hành  theo  phương  pháp  cắt ngang mô  tả, mẫu không xác  suất và  thuận tiện. Số liệu được nhập bằng Epi‐data 3.1  và xử lý bằng phần mềm Stata 11.0.  KẾT QUẢ   Trong nghiên cứu trước trong năm 2013, 369  chủng  Acinetobacter  baumannii  (16,13%)  được  phân  lập  từ  các bệnh phẩm  đàm, mủ, máu và  nước  tiểu  trong  số  2.288 mẫu  cấy dương  tính.  Chọn  ngẫu  nhiên  66  chủng  để  tiến  hành  thử  nghiệm, bao gồm: 4 chủng từ cấy máu, 2 chủng  từ  cấy  catheter  thông  tiểu,  6  chủng  từ mủ  vết  thương hậu phẫu và 54 chủng từ đàm.  Bảng 1: Tỷ lệ đề kháng kháng sinh của 66 chủng A. Baumannii thử nghiệm  Nhóm Kháng sinh Kháng (%) Nhạy (%) Trung gian (%) Amino glycoside Amikacine 81,13 11,32 7,55 Gentamycine 10µg 95 5 0 Netilmycine 80,39 19,61 0 Fluroquinolon Ciprofloxacine 94,12 5,88 0 Tetracycline Doxycyline 48,72 51,28 0 Cephem Cefatadizime 89,89 10,11 0 Cefotaxime 100 0 0 Cefpodoxim 100 0 0 Cefuroxim 98,04 1,96 0 Cefepime 88,89 11,11 0 β-lactam/ức chế β-lactamase Ampicillin/Sulbactam 42,86 42,86 14,29 Cephaperazone/Sulbactam 48,28 31,03 20,69 Piperacillin/ tazobactam 92,59 7,41 0 Ticarcillin/ clavulanic acid 89,19 5,41 5,41 Carbapenem Imipenem 90,2 9,8 0 Meropenem 92,73 5,45 0 Lipopeptide Colistin 0 100 0 Ức chế biến dưỡng Folate Bactrim 86,36 9,09 4,55 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014  Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Y Tế Công Cộng  461 Từ  bảng  1  thấy,  đa  số  A.  baumannii  thử  nghiệm kháng  cao với hầu hết  các kháng  sinh,  kháng  trung  bình  với  tetracycline  và  β‐ lactam/sulbactam  và  nhạy  100%  lipopeptide  (colistin).  Hình 2: Phương pháp multiplex PCR – ELISA phát  hiện Oxacillinase ở A. baumannii.  Bảng 2: MIC Meropenem và Imipenem ở 66  Acinetobacter baumannii thử nghiệm  Số chủng A. baumannii MIC của Meropenem MIC của Imipenem 2 0,125 0,25 1 0,38 0,38 1 0,75 0,5 1 4 0,19 1 14 2 60 >32 >32 Từ bảng 2 cho thấy, đa số các chủng trong lô  thử  nghiệm  (>  92%)  có MIC  (carbapenem)  >14  μg/ml. Đây  là các chủng Acinetobacter baumannii  có kiểu hình kháng carbapenem bằng E‐TEST.  Bảng 3: Các nhóm gene blaOXA trong số 66 chủng A.  baumannii nghiên cứu  PCR-ELISA BỆNH PHẨM MÁU NƯỚC TIỂU MỦ ĐÀM A. baumannii 4 2 6 54 blaOXA-23 4 0 6 45 blaOXA-40 0 0 0 0 blaOXA-51 4 2 6 50 blaOXA-58 0 2 0 9 Từ hình 3 và bảng 3 cho thấy, các nhóm gene  blaOXA‐23(kích  thước 501 bp), blaOXA‐58  (kích  thước  599 bp) và blaOXA‐51 (kích thước 353 bp) được phát  hiện  khi  tiến  hành  điện  di  sản  phẩm  DNA  khuếch  đại  trên  agarose  gel.  Nhóm  đầu  tiên  trong các chủng  thử nghiệm dương  tính với cả  OXA‐51  và  OXA‐23  (83,3%).  Nhóm  thứ  hai  dương tính với cả OXA‐51 và OXA‐58 (16,67%).  Nhóm thứ ba, chỉ dương tính với OXA‐58 (2 ca,  chiếm 0,03%).  Hình 3: Kết quả được thiết lập sau khi multiplex PCR  được tiến hành, sử dụng agarose gel 2% để phát hiện  các gene blaOXA trong các Acinetobacter baumannii.  BlaOXA‐51  là  một  gene  nội  tại  của  A.  Baumannii(6). Đây là gene nằm trên nhiễm sắc thể,  cần  thiết  để  điều  hoà  vùng  thượng  nguồn  bởi  ISAba1 để kích thích tính kháng carbapenem. Tỷ lệ  blaOXA‐51  trong  các  chủng Acinetobacter baumannii  phân  lập  từ  lâm sàng  trong  thử nghiệm này  là  gần  97%.  Số  liệu  này  thấp  hơn  các  phát  hiện  trong  nghiên  cứu  được  tiến  hành  ở  Iran  bởi  Feizabadi  và  cộng  sự  (2008),  theo  đó  có  100%  chủng có gene blaOXA‐51 (3).  Tỷ lệ blaOXA‐23 ở các chủng AB phân lập từ lâm  sàng  trong  nghiên  cứu  này  là  83,3%.  Phát  hiện  này cao hơn nhiều so tỷ lệ blaOXA‐23 chung là 66,5%  phát  hiện  ở  các  quốc  gia  Châu  Á‐Thái  Bình  Dương  (Ấn  Độ,  Trung  Quốc,  Thái  Lan,  Singapore, Hồng Kông và Hàn Quốc; không  có  Việt  Nam)(5).  Tuy  nhiên,  dựa  trên  nghiên  cứu  khác  được  tiến  hành  bởi  Feizabadi  và  cộng  sự  (2008), cho thấy có 36,5% các chủng Acinetobacter  baumannii  phân  lập  từ  lâm  sàng  có  tỷ  lệ mang  gene  blaOXA‐23  khác  biệt  nhau  ở  trên  thế  giới(3).  BlaOXA‐23  là một gene  đề kháng  carbapenem mắc  phải  nằm  trên  plasmid  của  Acinetobacter  baumannii,  vì  thế  có một  tỷ  lệ  khác  nhau  được  Nghiên cứu Y học  Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 6 * 2014 Chuyên Đề Y Tế Công Cộng 462 phát  hiện  so  với  gene  blaOXA‐51  là  gene  kháng  carbapenem xuất hiện  tự nhiên nằm  trên nhiễm  sắc thể của AB(6,7). Tỷ lệ blaOXA‐58 trong các AB phân  lập  từ  lâm  sàng  trong  nghiên  cứu  này  chiếm  16,67%. Số  liệu này cao hơn  tỷ  lệ 15% blaOXA‐58 ở  AB trong nghiên cứu của Feizabadi và cộng sự tại  Iran  năm  2008(3). BlaOXA‐58  là  gene  vừa  nằm  trên  nhiễm sắc thể, vừa nằm trên plasmid nên các tỷ lệ  phân lập trên thế giới có sự khác biệt(7).   Các kết quả này cũng phù hợp với các tổng  kết gần đây của Tada và cộng sự công bố năm  2013 tại chính 2 bệnh viện Bạch Mai và Chợ Rẫy,  theo đó trong cơ chế tiết enzyme phá hủy kháng  sinh  carbapenem,  các OXA‐carbapenemase  lớp  D (Ambler carbapenemase lớp D) phổ biến trên  toàn  thế  giới  và  khu  vực Châu  á  –  Thái  Bình  Dương lưu hành chủ yếu các chủng Acinetobacter  baumannii mang gene mã hóa nhóm OXA‐23(9).  KẾT LUẬN  Acinetobacter  baumannii  kháng  cao  với  hầu  hết  các  kháng  sinh,  kháng  trung  bình  với  tetracycline  và  β‐lactam/sulbactam  và  nhạy  100% lipopeptide.   Sau khi hoàn thành nghiên cứu này, có bằng  chứng  rõ  ràng  rằng  các  nhóm  gene  blaOXA  (carbapenemase  lớp D)  là một vấn đề trong các  chủng Acinetobacter  baumannii  phân  lập  từ  lâm  sàng  tại bệnh viện Đa khoa Thống Nhất, Đồng  Nai. Các nhóm blaOXA nằm trên plasmid (OXA‐23  và có thể là OXA‐58) có tỷ lệ khác biệt so với các  nghiên cứu khác trên thế giới.  Kỹ thuật multiplex PCR‐ELISA được chứng  minh là kỹ thuật nhanh và chính xác để kiểm tra  nhạy cảm kháng sinh. Tuy nhiên, vẫn còn nhiều  việc  phải  cải  tiến  để  có  thể  áp  dụng  kỹ  thuật  multiplex PCR như  là  1  chọn  lựa  thay  thế  cho  các xét nghiệm nhạy cảm kháng sinh hiện nay.  KIẾN NGHỊ  Khả năng Acinetobacter baumannii tăng trưởng  trong màng biofilms đặt ra một mối đe doạ  liên  quan  tới  khả  năng  lây  lan  của  chủng  vi  khuẩn  này, theo đó phát tán các gene kháng thuốc, cần  được điều tra nghiên cứu trong tương lai.  TÀI LIỆU THAM KHẢO  1. Bergogne‐Berezin  E.,  Towner KJ.  (1996). Acinetobacter  spp.  as  nosocomial  pathogens:  microbiological,  clinical,  and  epidemiological features. Clinical microbiology Reviews. 9(2) 148.  2. Brown S, Amyes SGB (2005). The sequences of seven class D  β‐lactamases  isolated  from  carbapenem‐resistant  Acinetobacter  baumannii  from  four  continents.  Clinical  Microbiology And Infection. 11(4), 326‐329.  3. Feizabadi  MM,  Fathollahzadeh  B,  Taherikalani  M  (2008).  Antimicrobial  susceptibility  patterns  and  distribution  of  blaOXA  genes  among  Acinetobacter  spp.  isolated  from  patients at Tehran hospitals. J Infect Dis. 61(4). 274‐8.  4. Lain  A.  Gustavo  MC.  Saruar  B.  Anton  YP.  (2013).  Carbapenem  resistance  in  Acinetobacter  baumannii.  Expert  Rev Anti Infect Ther. 11(4). 395 – 409.  5. Mendes RE, Bell JM, Turnidge JD, Castanheira M, Jones RN  (2009). Emergence and widespread dissemination of OXA‐23.  ‐24/40 and –58 carbapenemases among Acinetobacter spp  in  Asia‐Pacific  nations:  report  from  the  SENTRY  Surveillance  Program. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 63. 55‐59.  6. Merkier AK, Centrón D (2006). Bla‐OXA‐51‐type β‐lactamase  genes  are  ubiquitous  and  vary  within  a  strain  in  Acinetobacter baumannii. International Journal Of Antimicrobial  Agents. 28(2). 110‐113.  7. Perez  F,  Hujer  AM,  Hujer  KM,  Decker  BK,  Rather  PN,  Bonomo RA,  (2007). Global  challenge of multidrug‐resistant  Acinetobacter  baumannii.  Antimicrobial  agents  and  chemotherapy. 51(10). 3471‐3484.  8. Poirel  L,  Nordmann  P  (2006).  Carbapenem  resistance  in  Acinetobacter  baumannii:  mechanisms  and  epidemiology.  Clinical microbiology and infection. 12(9). 826‐836.  9. Tada T, Miyoshi‐Akiyama T, Kato Y (2013). Emergence of 16S  rRNA  methylase‐producing  Acinetobacter  baumannii  and  Pseudomonas  aeruginosa  isolates  in  hospitals  in  Vietnam.  BMC infectious diseases. 13(1). 251.  10. Villegas MV, Hartstein AI  (2003). Acinetobacter Outbreaks.  1977‐2000. Infection control and hospital epidemiology. 24(4). 284‐ 295.  Ngày nhận bài báo:       10/5/2014  Ngày phản biện nhận xét bài báo:   16/6/2014  Ngày bài báo được đăng:     14/11/2014