Phát hiện đột biến mất đoạn hai gen Alpha Globin (Sea) gây bệnh Αlpha Thalassemia bằng kỹ thuật PCR

27 Tóm tắt Đặt vấn đề: Chẩn đoán xác định người mang đột biến dị hợp tử --SEA có ý nghĩa lớn với việc chẩn đoán trước sinh. Chẩn đoán sớm thai bị Hb Bart’s có vai trò quan trọng cho tư vấn di truyền. Mục tiêu: Đánh giá hiệu quả của việc phát hiện đột biến --SEA bằng phương pháp PCR. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu: 66 mẫu DNA tách chiết từ 31 mẫu máu và 35 mẫu ối tươi/ối nuôi cấy đã làm xét nghiệm đột biến gen α globin bằng phương pháp lai phân tử ngược tại Trung tâm Tư vấn Di truyền, Bệnh viện Đại học Y Hà Nội. Các mẫu DNA được PCR bằng mồi đã thiết kế, sau đó điện di để xác định đột biến --SEA. So sánh kết quả giữa hai phương pháp. Kết quả: Đoạn mồi thiết kế đã khuếch đại thành công đoạn gen mang đột biến --SEA. 66/66 mẫu máu và mẫu ối có kết quả 100% tương đồng giữa hai phương pháp. Kết luận: PCR là một phương pháp chính xác, đơn giản, nhanh chóng và kinh tế trong chẩn đoán người mang gen cũng như chẩn đoán thai thi mang đột biến --SEA. Từ khóa: α-thalassemia, đột biến --SEA, PCR, kỹ thuật lai phân tử ngược. Detection of the (--SEA) double αlpha-globin gene deletion by simple PCR method Dao Thi Trang1, Hoang Thi Ngoc Lan1,2, Nguyen Thi Hao1, Bui Thi Lanh1, Hoang Thi Hai1, Doan Thi Kim Phuong1,3 1 Ha Noi Medical University 2 National Hospital of Obstetrics and Gynecology 3 Hanoi Medical University Hospital Abstract Background: Detecting the carriers of SEA double deletion, as well as fetuses with Hb Bart’s syndrome is essential to prenatal diagnosis.  Objectives: Evaluating accuracy and the cost-effectiveness of a simple PCR method in determining --SEA mutation.  Materials and methods: 66 DNA extraction products of 31 blood and 35 amniotic fluid samples were tested for --SEA mutation by hybridization technique in Genetic Counseling Centre, Hanoi Medical University Hospital. These samples were diagnosed --SEA mutation by the combined gap-PCR method (with the designed primers) and agarose gel electro- phoresis. The results of this PCR assay were compared with that of the reserved hybridization method. Results: These designed primers have made successful PCR to detect --SEA deletion. The results of the PCR assay were completely in concordance with that of the reserved hybridization method.  Conclusion: Application of PCR assay on detecting --SEA double alpha globin gene deletion is exact, simple, rapid (to- wards both blood and prenatal samples) and cost-effective in Vietnam. Keywords: α-thalassemia, --SEA mutation, PCR method, reserved hybridization technique. Phát hiện đột biến mất đoạn hai gen Alpha Globin (--SEA) gây bệnh Αlpha Thalassemia bằng kỹ thuật PCR Đào Thị Trang1, Hoàng Thị Ngọc Lan1,2, Nguyễn Thị Hảo1, Bùi Thị Lành1, Hoàng Thị Hải1, Đoàn Thị Kim Phượng1,3 1 Trường Đại học Y Hà Nội 2 Bệnh viện Phụ sản Trung ương 3 Bệnh viện Đại học Y Hà Nội doi:10.46755/vjog.2020.1.790 Tác giả liên hệ (Corresponding author): Đào Thị Trang, email: daotrang.dt39@gmail.com Nhận bài (received) 05/12/2019 - Chấp nhận đăng (accepted) 20/04/2020 NGHIÊN CỨU PHỤ SẢN/DI TRUYỀN Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 28 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Αlpha thalassemia là bệnh di truyền lặn trên nhiễm sắc thể thường do đột biến gen α-globin, gây thiếu máu tan máu mạn tính hoặc phù thai, thai chết lưu [1]. Xác định người mang đột biến --SEA có vai trò quan trọng trong tư vấn chẩn đoán trước sinh. Chẩn đoán sớm thai nhi mắc hội chứng Hb Bart’s có ý nghĩa đối với việc tiên lượng cho thai nhi, hạn chế những biến chứng nguy hiểm cho thai phụ và cung cấp thông tin di truyền hữu ích cho gia đình. Hiện nay, tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, các phương pháp phát hiện đột biến --SEA chủ yếu dựa vào kit thương mại với nguyên lý lai phân tử ngược. Phương pháp này có thể phát hiện được nhiều đột biến cùng lúc nhưng kỹ thuật phức tạp, tốn thời gian và giá thành cao. Trong khi đó, nhiều nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy đột biến mất đoạn lớn dạng SEA ở người có nguy cơ cao mang gen α-thalassemia lên đến 87,35 - 95% [2,3]. Do đó, trong nhiều trường hợp chỉ cần xác định đột biến SEA là đủ ý nghĩa lâm sàng. Trên thế giới cũng như trong nước đã có nhiều bệnh viện, trung tâm sử dụng phương pháp PCR để phát hiện đột biến --SEA. Tuy nhiên, phần lớn các tác giả sử dụng các cặp mồi giống nhau để khuếch đại đoạn gen α globin bình thường và đột biến --SEA với kích thước sản phẩm khá lớn, lần lượt là 1800 bp và 1349 bp, dẫn tới khó thực hiện và kéo dài phản ứng khuếch đại [4]. Từ những vấn đề thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện nghiên cứu nhằm mục tiêu: Phát triển kỹ thuật PCR với các đoạn mồi tự thiết kế, nhằm rút ngắn thời gian cũng như đơn giản hóa kỹ thuật xét nghiệm và tăng hiệu quả về mặt chi phí. Đánh giá tính chính xác của xét nghiệm PCR trong việc phát hiện người bệnh và thai nhi có đột biến --SEA bằng việc so sánh kết quả với phương pháp lai phân tử. 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu: 66 mẫu DNA được tách chiết từ 31 mẫu máu ngoại vi và 35 mẫu tế bào ối tươi/ối nuôi cấy của người hoặc thai nhi có chỉ định xét nghiệm đột biến gen α-thalassemia tại Bệnh viện Đại học Y Hà Nội từ tháng 4/2019 đến 10/2019. Nghiên cứu có sử dụng DNA của người bình thường và mẫu tế bào ối của thai không có nguy cơ mang đột biến --SEA để làm mẫu đối chứng. Phương pháp nghiên cứu: Mỗi mẫu DNA (tách chiết bằng kít của hãng Qiagen, Đức) được xác định đột biến gen bằng 2 phương pháp: lai phân tử ngược và PCR đột biến --SEA. So sánh kết quả phát hiện đột biến của 2 phương pháp. Thiết kế mồi: Các cặp mồi cho phản ứng PCR được thiết kế để khu- ếch đại đoạn gen α-globin bình thường và trình tự gen liền kề với đột biến --SEA. Sử dụng chương trình Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) để thiết kế mồi. Trình tự mồi được trình bày trong Bảng 1. Bảng 1. Trình tự mồi, nồng độ mồi và kích thước sản phẩm sau PCR Tên mồi Trình tự (5’ - 3’) Kích thước sản phẩm (bp) α/SEA(F) CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC 1019 α(R) TGAAGAGCCTGCAGGACCAGGTCAGT α/SEA(F) CGATCTGGGCTCTGTGTTCTC 669 SEA(R) ATATATGGGTCTGGAAGTGTATCCCTC Phản ứng PCR: Mỗi phản ứng 20 µl bao gồm: 8 µl PCR Master mix 2X (0,8 U/µl, ThermoFisher Scientific), 0,5 µl mỗi loại primer, 10 - 100 ng DNA (thể tích cho vào tùy thuộc nồng độ mẫu, không quá 20% thể tích phản ứng PCR), DMSO 0,5% 0,5 µl, Betaine 0,5M 2,5 µl, nước cất vừa đủ 20 µl. Chu trình nhiệt: 980C x 10s; 30 chu kỳ: 980C x 1s; 660C x 5s; 720C x 23s; 720C x 60s. Tổng thời gian PCR khoảng 31 phút. Sau khi PCR, điện di sản phẩm trên thạch agarose 1,5%, trong 35 phút. Kỹ thuật lai phân tử ngược: Sử dụng bộ kít Thalassemia Gene Diagnostic (Hy- bribio)/Thalassemia α-Globin StripAssay (ViennaLab) đã có chứng chỉ CE/IVD. Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 29 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Hình 1. Hình ảnh điện di phát hiện đột biến --SEA bằng kỹ thuật PCR và hình ảnh kết quả lai phân tử Hình 1.A. Điện di sản phẩm PCR với các cặp mồi thiết kế. Chú thích: L: Thang chuẩn; 1: mẫu chứng không đột biến --SEA, 2: mẫu chứng đồng hợp tử đột biến -- SEA, 3: mẫu chứng dị hợp tử đột biến --SEA (mẫu máu), 4 (mẫu tế bào ối tươi): đồng hợp tử đột biến --SEA; 5 (mẫu tế bào ối tươi): dị hợp tử --SEA; 6 (mẫu tế bào ối tươi): không đột biến --SEA. Hình 1.B. Hình ảnh kết quả lai tương ứng kết quả PCR 1 --> 6; Màng lai 1: Không phát hiện đột --SEA và các đột biến gen thalassemia khác được khảo sát. Màng lai 2: Đồng hợp tử đột biến --SEA. Màng lai 3: Dị hợp tử đột biến -- SEA. Thanh lai 4: Đồng hợp tử đột biến --SEA. Thanh lai 5: Dị hợp tử đột biến --SEA. Thanh lai 6: Không phát hiện đột --SEA và các đột biến gen α-thalassemia khác được khảo sát. Bảng 2. So sánh kết quả phát hiện đột biến --SEA trên mẫu máu, mẫu ối tươi và mẫu ối nuôi cấy Loại mẫu Mẫu máu Mẫu ối tươi/ối nuôi cấy Tỷ lệ phù hợp kết quả Phương pháp Kết quả Lai phân tử n (%) PCR n (%) Lai phân tử n (%) PCR n (%) Không đột biến 13 (41,9%) 13 (41,9%) 15 (42,9%) 15 (42,9%) 100% Dị hợp tử 17 (54,8%) 17 (54,8%) 14 (40%) 14 (40%) 100% Đồng hợp tử 1 (3,2%) (máu cuống rốn) 1 (3,2%) 6 (17,1%) 6 (17,1%) 100% Trong 31 mẫu máu và 35 mẫu ối, tỷ lệ phát hiện đột biến --SEA cho kết quả hoàn toàn trùng khớp với phương pháp lai phân tử ngược. A B Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 30 Bảng 3. So sánh kết quả phát hiện đột biến --SEA trên 16 mẫu ối tươi Phương pháp Kết quả Lai phân tử (ối nuôi cấy) n (%) PCR (ối tươi) n (%) PCR (ối nuôi cấy) n (%) Tỷ lệ phù hợp kết quả Không đột biến 6 (37,5%) 6 (37,5%) 6 (37,5%) 100% Dị hợp tử 6 (37,5%) 6 (37,5%) 6 (37,5%) 100% Đồng hợp tử 4 (25%) 4 (25%) 4 (25%) 100% Trong 35 mẫu ối của nghiên cứu, có 16 mẫu được thực hiện kỹ thuật PCR phát hiện đột biến --SEA trên cả hai loại mẫu (của cùng một bệnh nhân) là tế bào ối tươi và tế bào ối qua nuôi cấy. Kết quả phát hiện đột biến --SEA bằng PCR trên 16 mẫu ối tươi, cho kết quả phù hợp với ối nuôi cấy bằng cả hai phương pháp, lai phân tử ngược và PCR. Bảng 4. Độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp PCR với đột biến --SEA PCR Lai Có đột biến (n,%) Không đột biến (n,%) Tổng số Có đột biến 38 (57,6) 0 (0%) 38 Không đột biến 0 (0,0) 28 (42,4%) 28 Tổng số 38 (57,6) 28 (42,4%) 66 Độ nhạy và độ đặc hiệu của phương pháp PCR trong xét nghiệm xác định đột biến --SEA là 100% khi so với phương lai phân tử ngược. 4. BÀN LUẬN Mồi thiết kế đã khuếch đại được đoạn gen mang đột biến --SEA cũng như đoạn gen α-globin bình thường. Các cặp mồi được thiết kế lại giúp giảm nhiệt độ nóng chảy của mồi (Tm), tăng khả năng gắn mồi chính xác; cùng với việc sử dụng master mix phù hợp, thời gian khuếch đại chuỗi khi so với các phương pháp PCR, gap-PCR hoặc multiplex PCR trước đây, đã giảm từ hơn 2,5 giờ [6,7] xuống chỉ còn khoảng 30 phút. Phương pháp PCR trong nghiên cứu này cho thấy tính chính xác với độ nhạy và độ đặc hiệu là 100% khi so với kỹ thuật lai phân tử ngược (đã có chứng nhận CE/IVD). Theo nghiên cứu tại Trung tâm Chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2018 cho thấy tỷ lệ gặp đột biến dị hợp tử --SEA ở người có sàng lọc mang gen α-thalassemia lên đến 95% khi sử dụng phương pháp lai phân tử ngược. 91,5% trường hợp đột biến dị hợp tử --SEA nằm trong nhóm công thức máu có MCV và MCH giảm nhiều (MCV ≤ 75 fl và MCH ≤ 24 pg) [5]. Như vậy, với những trường hợp bệnh nhân có MCV, MCH giảm nhiều và HbA2 < 3,5% (không có Hb bất thường khác), việc thực hiện phương pháp PCR cho thấy hiệu quả về mặt chi phí, kỹ thuật và thời gian xét nghiệm (so sánh chi tiết được nêu trong Bảng 5). Trong các trường hợp phương pháp PCR không phát hiện đột biến --SEA hoặc nghi ngờ dị hợp tử kép, có thể thực hiện các phương pháp chẩn đoán phát hiện đa đột biến sau đó. Bảng 5. So sánh phương pháp lai và phương pháp PCR Phương pháp Tiêu chí Phương pháp lai Phương pháp PCR Trên thanh Trên màng Thời gian 7 - 8 giờ 4,5 - 5 giờ 70 phút Chi phí 5.000.000 đồng 3.500.000 đồng Khoảng 500.000 đồng Số đột biến phát hiện 21 đột biến α-thalassemia 5 đột biến α 16 đột biến β 1 đột biến --SEA Nồng độ DNA yêu cầu 2 - 20 ng/µl ~ > 50 ng/µl ≥ 2,5 ng/µl Mẫu thực hiện được Máu, tế bào ối nuôi cấy Máu, tế bào ối nuôi cấy Máu, tế bào ối nuôi cấy, tế bào ối tươi Trang thiết bị yêu cầu Máy PCR, buồng điện di, bể ổn nhiệt, máy ủ lắc Máy PCR, bể ổn nhiệt, máy lai của hãng Hybribio Máy PCR, buồng điện di Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790 31 Trong các trường hợp chẩn đoán trước sinh, kỹ thuật PCR thực hiện trên mẫu ối tươi và ối nuôi cấy cũng cho thấy kết quả hoàn toàn phù hợp với phương pháp lai phân tử ngược trên mẫu ối nuôi cấy. Một số nghiên cứu cũng cho thấy giá trị của phương pháp PCR trong chẩn đoán trước sinh hội chứng Hb Bart’s [7,8]. Nghiên cứu này bước đầu cho thấy ưu điểm của việc sử dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán trước sinh ở những đối tượng có nguy cơ sinh con bị Hb Bart’s, đặc biệt có thể thực hiện trên mẫu ối tươi không cần nuôi cấy tế bào (nồng độ thấp nhất chúng tôi làm trong nghiên cứu này là 2,5 ng/ µl). Phát hiện đột biến --SEA từ mẫu ối không cần nuôi cấy bằng phương pháp PCR cho kết quả sớm trong vòng 24 giờ sau khi nhận mẫu, là ưu điểm thiết yếu trong chẩn đoán di truyền trước sinh. 5. KẾT LUẬN Thiết kế mồi đã khuếch đại thành công được đột biến mất đoạn --SEA. Phương pháp PCR phát hiện đột biến --SEA cho kết quả chính xác, nhanh chóng, kỹ thuật đơn giản, hiệu quả về chi phí, và có độ nhạy, độ đặc hiệu là 100% khi so với phương pháp lai phân tử ngược. Kỹ thuật này cho thấy tiềm năng phát hiện đột biến trên cả mẫu tế bào ối không cần thời gian nuôi cấy trong chẩn đoán trước sinh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Weatherall, D.J. Thalassemia as a global health prob- lem: recent progress toward its control in the developing countries. Ann N Y Acad Sci. 2010; 1202: 17-23. 2. Bui Thi Kim L., D. Phu Chi, C. Hoang Thanh. Spectrum of Common alpha-Globin Deletion Mutations in the Southern Region of Vietnam. Hemoglobin. 2016; 40(3): 206-7. 3. Nguyễn Thị Vân Anh, Vũ Hương Ly, Lê Phương Thảo, Trần Danh Cường. Đặc điểm đột biến gen globin của những đối tượng nguy cơ cao sinh con mắc thalassemia tại Trung tâm chẩn đoán trước sinh Bệnh viện Phụ sản Trung ương năm 2018. Tạp chí Phụ sản. 2019; 16(3): 22-27. 4. Chong, S.S., et al. Single-tube multiplex-PCR screen for common deletional determinants of α-thalassemia. Blood. 2000; 95(1): 360-362. 5. Hoàng Thị Ngọc Lan, Nguyễn Vân Anh, Lê Phương Thảo, Đoàn Thị Kim Phượng, Phan Thu Giang. Giá trị của MCV, MCH trong sàng lọc bệnh alpha-thalassemia của các thai phụ tại Trung tâm chẩn đoán trước sinh - Bệnh viện Phụ sản Trung ương. Tạp chí Phụ sản. 2019; 16(3): 28-34. 6. Liu, Y.T., et al. Rapid detection of alpha-thalassaemia deletions and alpha-globin gene triplication by multi- plex polymerase chain reactions. Br J Haematol. 2000; 108(2): 295-9. 7. Jomoui, W., et al. Genetic origin of α(0)-thalassemia (SEA deletion) in Southeast Asian populations and ap- plication to accurate prenatal diagnosis of Hb Bart’s hydrops fetalis syndrome. Journal of Human Genetics. 2017; 62(8): 747-754. 8. Karnpean, R., et al. Accurate Prenatal Diagnosis of Hb Bart’s Hydrops Fetalis in Daily Practice with a Dou- ble-Check PCR System. Acta Haematol. 2009; 121(4): 227-33. Đào Thị Trang và cs. Tạp chí Phụ sản 2020; 18(1):27-31. doi: 10.46755/vjog.2020.1.790