Sản xuất kháng thể thỏ chống Fcγ người gắn Fitc
KẾT LUẬN
Với đội ngũ cán bộ và máy móc trang bị
hiện có chúng tôi đã bào chế thành công
kháng thễ thỏ đặc hiệu Fcγ người gắn FITC có
chất lượng ít nhất cũng tương đương với sản
phẩm chúng tôi vẫn mua ở nước ngoài để sử
dụng (từ công ty DAKO). Các kỹ thuật hóa
miễn dịch được sử dụng bao gồm tủa IgG
trong Ammonium Sulfate, cắt phân tử IgG với
Papain, SKAL Agorose – Protein A và SKAL
Fcγ để tinh chế Fcγ người và IgG thỏ đặc hiệu
chống Fcγ người. Tiến trình của quá trình
cộng hợp IgG đặc hiệu với FITC không gặp
một trỏ ngại lớn nào.Việc sử dụng kháng thể
huỳnh quang tự chế này trong các kỹ thuật
miễn dịch huỳnh quang mô học được thực
hiện theo quy trình thường quy của phòng thí
nghiệm. Hiện nay chúng tôi đã sử dụng hoàn
toàn kháng thể huỳnh quang tự chế trong xét
nghiệm thường quy về hóa mô miễn dịch
huỳnh quang.
5 trang |
Chia sẻ: hachi492 | Ngày: 26/01/2022 | Lượt xem: 316 | Lượt tải: 0
Bạn đang xem nội dung tài liệu Sản xuất kháng thể thỏ chống Fcγ người gắn Fitc, để tải tài liệu về máy bạn click vào nút DOWNLOAD ở trên
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 42
SẢN XUẤT KHÁNG THỂ THỎ CHỐNG Fcγ NGƯỜI GẮN FITC
Nguyễn Lê Trang*, Phạm Hoàng Phiệt*, Lê Thị Thanh,
Nguyễn Thị Huyền Ngọc, Âu Thị Chi Lan, Nguyễn Thị Nguyệt Thu
TÓM TẮT
Đặt vấn đề: Việc trang bị phòng thí nghiệm ngày một tốt hơn kèm với đội ngũ những người làm
chuyên về hóa miễn dịch hiện có trong phạm vi Tp Hồ chí Minh, chúng tôi tin rằng mình có thể sản xuất
được một số sinh phẩm miễn dịch có chất lượng dùng trong phòng thí nghiệm. Trong nghiên cứu này
chúng tôi đặt mục tiêu là sản xuất kháng thể thỏ chống Fcγ người gắn FITC dùng trong miễn dịch huỳnh
quang tổ chức.
Vật liệu, phương pháp và kết quả: Sơ chế IgG người được thực hiện bằng việc cho tủa tập họp
huyết thanh người bình thường trong Ammonium Sulfate 45% bão hòa. IgG sơ chế này được xử ly với
Papain để cắt làm Fcγ và Fab. Dùng cột SKAL Agarose-Protein A để thu hồi Fcγ tinh khiết. Kháng
nguyên Fcγ người được gây miễn dịch cho thỏ để thu hồi kháng thể thỏ chống Fcγ. Phân lập kháng thể đặc
hiệu khỏi globuline miễn dịch chung của thỏ bằng cột SKAL- Fcγ người. Kháng thể thỏ đặc hiệu này được
cộng hợp với FITC để có kháng thể huỳnh quang đặc hiệu. Kháng thể huỳnh quang tự sản xuất của chúng
tôi có hệ số F/P là 1,8 và hàm lượng IgG là 7,6mg/ml.
Sử dụng trong kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang tổ chức để phát hiện tự kháng thể thì kháng thể huỳnh quang tự chế
của chúng tôi ít nhất cũng tương đương với kháng thể huỳnh quang mà chúng tôi mua từ công ty DAKO.
Từ khóa: sắc ký ái lực, miễn dịch huỳnh quang, globuline miễn dịch, Fcγ
ABSTRACT
PRODUCTION OF FITC CONJUGATED RABBIT ANTI HUMAN FCΓ
Nguyen Le Trang, Nguyen Thi Huyen Ngoc, Le Thi Thanh, Au Thi Chi Lan, Nguyen Thi Nguyet Thu,
Pham Hoang Phiet * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 1 - 2011: 42 - 46
Background: With the improvement of Laboratory equipments and our team Immunochemical experts
available now in HCM city we believe that we are able to produce many immuno reagents commonly used
in our laboratory. In this study,we aim to produce the FITC conjugated Rabbit anti human Fcγ.
Materials, methods and results: For production of purified human Fcγ, we precipitate a pooled
human serum with 45% SAS then digeste the precipitated human IgG with Papain. The purified human
Fcγ was obtained from digested IgG by using the Agarose-Protein A Column. Rabbits were immunized
with this purified human Fcγ to get antiserum. Then specific Rabbit antibody against human Fcγ were
collected by using human Fcγ affinity column. The specific Rabbit antibody was conjugated with FITC to
produce fluorescent specific Rabbit antibody anti human Fcγ. Our fluorescent antiserum has the F/P ratio
of 1.8 and the IgG concentration of 7.6mg/ml.
In Fluorescent Immuno histo chemistry technique to detectect auto antibodies, our fluorescent
antiserum is at least as good as those bought from DAKO company.
Khoa Xét nghiệm, Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Bệnh viện Nhi đồng 2 TP Hồ Chí Minh
Bộ môn Miễn dịch, Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh
Viện Pasteur TP Hồ Chí Minh
Địa chỉ liên hệ: CN. Lê Thị Thanh ĐT: 0908421927. Email: lethanh_9999@yahoo.com
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 43
Key words: affinity chromatography, immunofluorescent, immunoglobulin.
MỞ ĐẦU
Phát hiện sự có mặt của globuline miễn
dịch người được sử dụng để chẩn đoán trong
nhiều bệnh lý nhiễm khuẩn và bệnh tự miễn.
Cho đến nay chúng ta vẫn phải nhập thuốc
thử của ngước ngoài với giá không rẻ và phải
chờ đợi sau khi đặt hàng. Với việc trang bị
máy móc về hóa miễn dịch hiện nay của các
phòng nghiên cứu, các bệnh viện cùng với đội
ngũ cán bộ chuyên ngành hóa miễn dịch sẵn
có vvchúng tôi nghĩ rằng chúng ta hoàn
toàn có khả năng tự sản xuất được một số sản
phẩm sinh học thông dụng cho chẩn đoán
miễn dịch với chất lượng không thua kém các
sản phẩm mua từ nước ngoài. Trong nghiên
cứu này chúng tôi đặt mục đích là sản xuất
được kháng thể đa dòng của thỏ gắn FITC
chống Fcγ người là thí điểm ban đầu.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
Các hóa chất và vật liệu chuyên biệt
dung trong nghiên cứu này bao gồm:
- Cột sắc ký ái lực Agarose – Protein A của
hãng BioRad.
- Tá dược FCA và FIA của hãng Sigma.
- CNBr – Sepharose hoạt tác dạng khô của
hãng Amersham.
- Papaine (Mercuripapain) hãng Sigma.
- FITC của hãng Sigma (mã P3125).
- Kháng thể thỏ chống chuỗi nặng gamma
người cộng hợp FITC của hãng DAKO (có hệ
số F/P = 2,65 và hàm lượng IgG là 3mg/ml)
dùng để so sánh.
Các hóa chất thông thường để pha đệm
các loại mua của hãng Amersham, Sigma.
Tập hợp huyết thanh người bình thường
được tích lại từ các đối tượng kiểm tra sức
khỏe mà kết quả bình thường và âm tính với
HBsAg, anti HCV và anti HIV được giữ trong
tủ lạnh sâu – 20oC đến lúc sử dụng.
Các công đoạn của quá trình sản xuất Fcγ
người được thực hiện như sau:
- Sơ chế IgG người: huyết thanh người sau
khi đã rã đông được tập hợp lại và ly tâm
6000 vòng/30 phút. Hút phần trong và loại bỏ
cặn. Phần huyết thanh này được pha loãng ½
trong đệm Sodium Phosphate 0,1M – pH 7.2.
Khuấy nhẹ trên máy khuấy từ ở nhiệt độ
phòng và từ từ nhỏ vào trong huyết thanh
dung dịch Ammonium Sulfate bão hòa một
thể tích để có độ bão hòa là 45% - Huyết
thanh sẽ hình thành tủa lắng xuống. Để dung
dịch qua đêm ở 4 oC.
- Hôm sau loại bỏ nước trong và rửa lại
tủa trong dung dịch Ammonium Sulfate 45%
và ly tâm loại bỏ nước trong giữ tủa. Tiếp đến
ta cho tan tủa với đệm Sodium Phosphate
0,05M – pH 7,2 với một thể tích bằng hoặc
nhỏ hơn thể tích huyết thanh ban đầu. Chú ý
cần cho đệm vào từ từ và lắc nhẹ để tủa tan
dần và hoàn toàn. Ly tâm bỏ cặn và lấy nước
trong. Để loại sạch muối Ammonium Sulfate
ta thẩm tích trong đệm Phosphate qua đêm ở
4 oC ( cũng có thể loại trừ muối Ammonium
Sulfate bằng cách cho dung dịch đi qua cột
sắc ký lọc Sephadex G25 Superfine). Tiếp theo
ta ly tâm lấy nước trong. Đây chính là IgG sơ
chế để thực hiện giai đoạn tiếp theo. Kiểm tra
mức tinh khiết của IgG trên điện di SDS –
PAGE và xác định hàm lượng IgG bằng đo ở
bước song 280nm.
- Tinh chế Fcγ người: Dung dịch IgG
người sơ chế được cân bằng trong đệm
Sodium Phosphate 0,1M – pH 7,0 có 0,01M
Cystein và 2mM Na2EDTA. Tính hàm lượng
IgG trong dung dịch để cho Papain với tỷ lệ
Papain/IgG = 1/100. Ủ dung dịch ở 37 oC trong
4 giờ, môi trường này thuận lợi cho xúc tác
phản ứng cắt phân tử của papain để cho 1 Fcγ
và 2 Fab. Ngưng phản ứng bằng cách cho
thêm vào dung dịch các tinh thể
iodoacetamide để đạt nồng độ 0,1 mg/ml.
Tiếp theo ta thẩm tích dung dịch này trong
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 44
đệm Sodium phosphate 0,1M – pH 7,0 ở 4 oC
qua đêm.
- Thu hồi Fcγ tinh chế với cột sắc ký ái lực
(SKAL) Agarose-Protein A. Rửa cột SKAL
Agarose Protein A với 25ml đệm gắn (Sodium
phosphate 0,02M – pH 7,4 tiếp đến cho dần
dung dịch IgG người đã xử lý Papain đi qua
cột và rửa tiếp với đệm gắn. Theo dõi sắc ký
đồ về lượng protein đi ra từ cột đến khi sạch
thì chuẩn bị cho thì giải hấp Fcγ tinh chế.
- Đệm giải glycin 1M – pH 3,0: dưới tác
dụng của pH thấp và nồng độ phân tử cao,
các lực liên kết yếu giữa Fcγ và Protein A bị
tách ra và Fcγ theo đệm giải ra ngoài cột. Để
Fcγ không bị phân hủy bởi pH thấp của đệm
giải ta chuẩn bị sẵn ở ống hứng mỗi ống 1ml
đệm trung hòa TRIS 1M – pH 9,0. Thẩm tích
dung dịch thu hồi Fcγ trong đệm Sodium
phosphate 0,05M – pH7,2 qua đêm ở 4oC. Đo
độ protein được giải ra ở bước song 280nm và
kiểm tra mức tinh khiết với điện di SDS –
PAGE.
Gây miễn dịch trên thỏ với kháng
nguyên Fcγ người:
Thỏ 1 năm tuổi có trọng lượng trên 2kg
được sử dụng để gây miễn dịch.
Dung dịch kháng nguyên Fcγ trong PBS có
thể tích 0,5ml được làm thành nhũ tương
nước trong dầu (water in oil) với 0,5ml tá
được Freund và tiêm vào trong da dọc theo 2
bên cột sống, mỗi bên 2 dãy và mỗi dãy 10
điểm ( mỗi điểm 25l). Mỗi lần tiêm cách
nhau 4 tuần với tổng số 7 lần tiêm gồm 1 lần
gây mẫn cảm và 6 lần tiêm nhắc. Lượng
kháng nguyên tiêm được giảm dần theo thứ
tự liều tiêm như sau 100g, 100g, 50g, 25g,
20g, 20g và 20g. Với tá dược lần đầu là
Freund hoàn chỉnh (FCA)và sau đó là Freund
không hoàn chỉnh(FIA). Sau lần tiêm nhắc thứ
hai 2 tuần lấy máu thử hiệu giá kháng thể
chống Fcγ bằng kỹ thuật Ouchterlony. Chỉ sử
dụng các thỏ có hiệu giá kháng thể từ 1/16 trở
lên mà thôi. Sau lần tiêm nhắc 3, 4, 5 ba tuần
lấy máu mỗi thỏ khoảng 50ml và tiếp tục nuôi
dưỡng và sau lần tiêm nhắc thứ sáu 3 tuần thì
lấy máu toàn bộ. Máu lấy được ly trích huyết
thanh và cho tủa trong Ammonium Sulfate
như trên để sơ chế IgG thỏ.
- Để thu được IgG thỏ đặc hiệu chống Fcγ
người chúng tôi dùng dung dịch IgG thỏ sơ
chế trong đệm Sodium phosphate đi qua cột
SKAL- Fcγ do chúng tôi tự tạo ra(1). Kháng
thể thỏ đặc hiệu được giữ lại và chỉ thoát ra
khi sử dụng đệm giải. Cách tiến hành như khi
thực hiện với cột Agarose - Protein A đã trình
bày ở trên.
Cộng hợp FITC lên kháng thể đặc hiệu
thỏ:
Dung dịch IgG thỏ đặc hiệu (đậm độ
protein 8,8mg/ml) được khuấy nhẹ rồi từ
từ cho đệm Sodium Bicarbonate 0,5M – pH 9,0
vào để pH đạt đến 8,5. Tiếp theo từ từ cho
dung dịch FITC trong cồn tuyệt đối
(50mg/500ml) để đạt đậm độ FITC 2mg/ml và
để khuấy từ 4 oC qua đêm. Hôm sau đem thẩm
tích dung dịch trong đêm PBS pH 7,2 ở 4 oC
một ngày và cho qua cột Sephadex G25. Phân
khúc chảy ra trước là IgG thỏ cộng hợp với
FITC còn FITC tự do (không cộng hợp với
protein) ra sau.
Dung dịch IgG thỏ cộng hợp FITC được
quét trên máy quang phổ với bước sóng từ
250 nm đến 600nm. Từ kết quả này tính được
tỷ lệ F/P (phân tử FITC/phân tử IgG) và nồng
độ IgG.
F/P = (2,77 x Abs 495) / [Abs 280 – (0,35
x Abs 495)]
Và IgG (mg/ml) = [Abs280 – (0,35 x Abs
495)] / 1,4
Các hệ số 2,77 và 0,35 được sử dụng
theo khuyến cáo của nhà sản xuất FITC
(Sigma) mà chúng tôi sử dụng.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Từ 100ml tập hợp huyết thanh người bình
thường qua tủa trong Ammonium Sulfate
chúng tôi thu được khoảng 430mg IgG người
sơ chế. Kỹ thuật tủa này là đơn giản, không
Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011 Nghiên cứu Y học
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản 45
đòi hỏi máy móc và thiết bị phức tạp mà lại
cho phép tiến hành với một số lượng lớn
huyết thanh (2). Tuy nhiên IgG sơ chế có độ
tinh khiết không cao như chúng ta thấy trên
kiểm tra qua điện di SDS – PAGE cả trước và
sau xử lý với β-mercaptoethanol. Tuy nhiên
nguyên liệu IgG sơ chế này đủ để tiến hành
phân cắt với papain và từ đó thu hồi Fcγ
người tinh khiết vì chúng tôi còn sử dụng cột
SKAL Agarose – Protein A để tinh chế sau đó.
Sử dụng 87mg IgG người sơ chế xử lý với
papain trong môi trường thích hợp và dùng
cột SKAL Agarose – Protein A để thu hồi Fcγ
người tinh khiết (1). Kết quả thu hồi của chúng
tôi là 29mg Fcγ. So sánh với lượng đưa vào
chúng tôi thu lại 29/87= 33,3%; tỷ lệ này rất
phù hợp với lý thuyết vì khi phân cắt phân tử
IgG sẽ cho 1/3 là Fcγ còn 2/3 là ở dạng Fab(8).
Chính nhờ liên kết đặc hiệu của Protein A với
thụ thể Fc nên đã cho phép bước chuẩn bị IgG
người không bắt buộc có độ tinh khiết cao.
Trong quá trình gây miễn dịch trên thỏ.
Thoạt đầu chúng tôi nuôi 4 thỏ ở 6 tháng tuổi
có trọng lương trên 1kg song sau 6 tháng chỉ
3 thỏ đạt trên 2 kg và được sử dụng để gây
miễn dịch. Tiêm kháng nguyên trong tá dược
Freund phải được chuẩn bị ở dạng nước trong
đầu mới gây được áp ứng miễn dịch tốt. Đặc
điểm khi tiêm chúng tôi sử dụng nhiều mũi
tiêm (40 mũi tiêm mỗi lần) với thể tích tiêm
chỉ 25ul mỗi mũi.Thể tích nhỏ để tránh gây
hoại tử tại chỗ nhất là ở mũi đầu khi dùng tá
dược là FCA. Mặt khác việc tiêm lặp lại nhiều
lần với lượng kháng nguyên giảm dần tạo
điều kiện để có các dòng kháng thể có đặc
hiệu cao và ái lực tốt. Sau 2 lần tiêm nhắc cả 3
thỏ đều đạt hiệu giá kháng thể từ 1/32 đến
1/64 nên đều được sử dụng để bào chế IgG
thỏ đặc hiệu chống Fcγ người bằng cột SKAL
Sepharose- Fcγ người (3). Kết quả số máu lấy
được từ 3 thỏ là 577ml và chiết ra được 300ml
huyết thanh. Tổng lượng IgG thỏ sơ chế ước
tính là 2800mg. Sử dụng 117mg IgG thỏ sơ chế
để chiết ra IgG thỏ đặc hiệu chúng tôi thu
được 36,5mg IgG thỏ đặc hiệu (31,2%). Đây là
một tỷ lệ cao chứng tỏ đáp ứng miễn dịch trên
thỏ rất tốt.Tiến hành cộng hợp FITC vào
kháng thể chúng tôi sử dụng trong đệm
Sodium Bicarbonate ở độ kiềm cao đã được
nhiều tác giả áp dụng(4).
Sau khi tiến hành cộng hợp IgG đặc hiệu
với FITC và qua cột SKL Sephadex G25,từ
hàm lượng IgG ban đầu là 8,8 mg/L ta thu
được IgG cộng hợp có hàm lượng IgG là 7,6
mg/ml (tỷ lệ thu hồi 86%) và có hệ số F/p là
1,8.
Tiến hành song song kỹ thuật miễn dịch
huỳnh quang tổ chức để phát hiện kháng thể
tự miễn lớp IgG bằng kháng thể huỳnh quang
của hang DAKO và của chúng tôi trên các
bệnh Lupus đỏ hệ thống, bệnh Graves(6,7,9). Có
3 mẫu âm tính và 15 mẫu dương tính đều phù
hợp. Độ pha loãng của kháng thể DAKO là
1/40 và của chúng tôi là 1/120 (có độ sáng
tương đương hoặc của chúng tôi còn sáng
hơn). Tuy nhiên do hàm lượng IgG thỏ trong
kháng thể huỳnh quang của chúng tôi cao
hơn (7,6 mg/ml so với 3 mg/ml) nên tính đậm
độ kháng thể ở thức pha loãng sử dụng thì 2
loại là tương đương: của DAKO là 0,075
mg/ml và của chúng tôi là 0,063 mg/ml.
Theo ước tính của chúng tôi việc sản xuất
trong nước giá thành sản phẩm chỉ khoảng
50% hay thấp hơn so với mua của nước ngoài.
KẾT LUẬN
Với đội ngũ cán bộ và máy móc trang bị
hiện có chúng tôi đã bào chế thành công
kháng thễ thỏ đặc hiệu Fcγ người gắn FITC có
chất lượng ít nhất cũng tương đương với sản
phẩm chúng tôi vẫn mua ở nước ngoài để sử
dụng (từ công ty DAKO). Các kỹ thuật hóa
miễn dịch được sử dụng bao gồm tủa IgG
trong Ammonium Sulfate, cắt phân tử IgG với
Papain, SKAL Agorose – Protein A và SKAL
Fcγ để tinh chế Fcγ người và IgG thỏ đặc hiệu
chống Fcγ người. Tiến trình của quá trình
cộng hợp IgG đặc hiệu với FITC không gặp
một trỏ ngại lớn nào.Việc sử dụng kháng thể
huỳnh quang tự chế này trong các kỹ thuật
Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 1 * 2011
Chuyên Đề Khoa học Cơ bản – Y tế Công cộng 46
miễn dịch huỳnh quang mô học được thực
hiện theo quy trình thường quy của phòng thí
nghiệm. Hiện nay chúng tôi đã sử dụng hoàn
toàn kháng thể huỳnh quang tự chế trong xét
nghiệm thường quy về hóa mô miễn dịch
huỳnh quang.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Fahey J.L. (1967). Chromatographic separation of
immunoglobulins in method of immunology. 321-332,
Chase M & WIlliams C.A . Academic Press inc: Newyork.
2. Heide K., Schwick H.G. (1973). Salt fractionation of
immunoglobulins in immunochemistry. DM.Weir. Chapter
6. Blackwell Scientific Publication.
3. Hermanson G.T., Krishna A., Mallia P.K (1992). Smith
immobilized affinity Ligand Techniques chapter 3.
Academic press.
4. Hudson L., Hay FiC. (1980). Practical immunology, chapter
7. Isolation and structure of immunoglobulins. Blackwell
Scientific.
5. Nguyễn Thị Huyền Ngọc (2010). Thu thập IgG người lành
làm kháng nguyên để tạo kháng thể đặc hiệu. Luận văn thạc
sĩ. Trường Đại học khoa học tự nhiên,Thành phố
Hồ chí Minh.
6. Rose Noel R., Mackay Ian R. (1998). The Autoimmune
Diseases. Chapter 17: Systemic Lupus Erythematosus.
Acadamic Press, Third Edition.
7. Rose Noel R., Mackay Ian R. (1998). The Autoimmune
Diseases. Chapter 22: Autoimmune Thyroid Diseasee.
Acadamic Press, Third Edition.
8. Stanworth DR., Turner M.W. (1986). Immunochemical
analysis of human and rabbit immunoglobulins and their
subunits in immunochemistry. Chapter 12, D.M. Weir.
Blackwell Scientific Publications.
9. Stites D.P. , Terr Abba I. , Parslow Tristam G. (1994). Basic
and Clinical Immunology. Chapter 12: Clinical Laboratory
Methods for detection of Antigens and Antibodies.
Appleton & Lange.
Các file đính kèm theo tài liệu này:
- san_xuat_khang_the_tho_chong_fc_nguoi_gan_fitc.pdf