Tiêu chuẩn hóa hợp chất 5-Methylthiazol-2-ylamin để làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm tạp chất liên quan của Meloxicam

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 175 TIÊU CHUẨN HÓA HỢP CHẤT 5-METHYLTHIAZOL-2-YLAMIN ĐỂ LÀM CHẤT ĐỐI CHIẾU SỬ DỤNG TRONG KIỂM NGHIỆM TẠP CHẤT LIÊN QUAN CỦA MELOXICAM Nguyễn Thị Tú Quyên*, Lưu Thảo Phúc Trường*, Nguyễn Đức Tuấn** TÓM TẮT Đặt vấn đề – Mục tiêu nghiên cứu: Trong nghiên cứu và sản xuất thuốc thành phẩm, các tạp chất liên quan có thể làm thay đổi hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc. Một số chuẩn tạp vẫn chưa có hoặc nếu có thường rất đắt tiền. Trong khi đó, nhiều chuyên luận trong Dược điển Việt Nam IV có qui định kiểm tra tạp chất liên quan trong cả nguyên liệu và thành phẩm tương ứng như meloxicam, metformin, . Vì vậy đề tài này được thực hiện với mục tiêu tinh chế và tiêu chuẩn hóa hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin để làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm tạp chất liên quan của meloxicam. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Tinh chế hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B), xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết và tiêu chuẩn hóa chất này. Xây dựng quy trình định lượng tạp B trong nguyên liệu và chế phẩm meloxicam. Kết quả: 5-methylthiazol-2-ylamin đã được tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại trong methanol. Độ tinh khiết của tạp B sau khi tinh chế trên 99%. Quy trình xác định độ tinh khiết tạp B bằng phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký thích hợp đã được xây dựng và thẩm định, có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng và độ chính xác cao. Đã xây dựng dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật 5-methylthiazol- 2-ylamin với các chỉ tiêu: tính chất, định tính và độ tinh khiết. Quy trình định lượng tạp B trong meloxicam bằng HPLC với điều kiện sắc ký giống như quy trình xác định độ tinh khiết tạp B và đã được thẩm định theo hướng dẫn của ICH. Kết luận: 5-methylthiazol-2-ylamin đã được tiêu chuẩn hóa để làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm tạp B của meloxicam. Quy trình định lượng tạp B đã được ứng dụng để kiểm tra mẫu nguyên liệu và chế phẩm meloxicam, đều cho kết quả đạt yêu cầu về giới hạn của tạp chất 5- methylthiazol-2-ylamin theo quy định của Dược điển Việt Nam IV. Từ khóa: 5-methylthiazol-2-ylamin, tạp chất liên quan của meloxicam, HPLC. ABSTRACT STANDARDIZATION OF 5-METHYLTHIAZOL-2-YLAMINE AS REFERENCE SUBSTANCE FOR RELATED SUBSTANCE TEST OF MELOXICAM Nguyen Thi Tu Quyen, Luu Thao Phuc Truong, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 175 - 181 Objective: In pharmaceutical research and manufacture, the presence of related impurities may influence the efficacy and safety of the pharmaceutical products. Some impurity standards are not available, the others are so expensive. Many API and FP monographs such as meloxicam, merformin, etc in Vietnamese Pharmacopoeia IV require conducting impurities tests. Therefore, the aim of this study was to purify and standardize 5- methylthiazole-2-ylamine chemical as reference substance for related substance test of meloxicam. Subjects and Methods: 5-methylthiazole-2-ylamine (impurity B) was purified, quantified, and * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: DS. Nguyễn Thị Tú Quyên ĐT: 0913799068 Email: diemnhim@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 176 standardized. Then, a HPLC assay of impurity B in meloxicam raw materials and corresponding pharmaceuticals was developed and applied. Results: 5-methylthiazole-2-ylamine was purified by recrystallization in methanol. The resultant product‘s purity was over 99%. A HPLC method for quantitation of impurity B was developed and validated according to ICH guidelines. The method showed selective, wide linearity range, high precision and accuracy. The impurity B was standardized on appearance, identification and purity. Conclusion: 5-methylthiazole-2-ylamine was standardized as reference substance for impurity B test of meloxicam. The validated HPLC method was successfully applied for impurity B test of meloxicam raw material and corresponding pharmaceuticals. The results showed that both samples complied with requirements for monograph meloxicam of Vietnam Pharmacopoeia IV in related substance test. Key words: 5-methylthiazole-2-ylamine, related substance of meloxicam, HPLC. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nghiên cứu và sản xuất thuốc thành phẩm, các tạp chất liên quan có thể làm thay đổi hiệu quả lâm sàng và đặc tính an toàn của thuốc. Ngoài ra, việc sử dụng thuốc generic cho bệnh nhân để giảm chi phí điều trị đòi hỏi các cơ quan kiểm nghiệm phải kiểm soát chặt chẽ chất lượng và hiệu quả của thuốc so với thuốc gốc, đặc biệt là hàm lượng hoạt chất và tạp chất phân hủy. Hiện nay, việc điều chế các tạp chất liên quan chưa được quan tâm nhiều tại Việt Nam. Một số chuẩn tạp vẫn chưa có hoặc nếu có thường rất đắt tiền và phải mua từ nước ngoài. Trong khi đó, nhiều chuyên luận trong Dược điển Việt Nam IV có qui định kiểm tra tạp chất liên quan trong cả nguyên liệu và thành phẩm tương ứng như meloxicam, metformin,... (1). Vì vậy, đề tài này được thực hiện với mong muốn góp phần ứng dụng vào việc kiểm tra tạp chất liên quan của nguyên liệu và thành phẩm chứa meloxicam. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Hóa chất 5-methylthiazol-2-ylamin, độ tinh khiết 98%, số lô A0275029, lọ 5 g, được sản xuất bởi công ty Acros organics (Bỉ). Hạn dùng: 07/2015. Chất chuẩn đối chiếu Meloxicam chuẩn do viện kiểm nghiệm thuốc TP.HCM cung cấp. Số kiểm soát: QT 089060911. Hàm lượng 99,35% tính trên chế phẩm nguyên trạng. Điều kiện bảo quản: 5°C. Trang thiết bị, hóa chất và dung môi Trang thiết bị Bể siêu âm Elma T840DH (Đức). Cân phân tích điện tử KERN ABS 220-4 (Đức). Máy đo điểm chảy Stuart SMP10 (Anh). Máy đo phổ hồng ngoại Shimadzu FTIR-8201PC (Nhật). Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Waters 2695, đầu dò PDA 2996 (Mỹ). Hóa chất, dung môi Methanol (MeOH), isopropanol dùng cho sắc ký lỏng (Merck). Triethylamin (TEA), natri hydroxyd, methanol, dicloromethan, n-hexan, aceton đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Phương pháp nghiên cứu Tinh chế 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B của meloxicam) Áp dụng phương pháp kết tinh trong dung môi. Sơ bộ kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm kết tinh bằng nhiệt độ nóng chảy và sắc ký lớp mỏng. Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp B Áp dụng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, cột sắc ký pha đảo C18. Trong quá trình thực nghiệm, một số điều kiện sắc ký ảnh hưởng đến khả năng tách và độ chọn lọc đã được khảo sát như thành phần và tỷ lệ dung môi pha động, tốc độ dòng, thêm base hữu cơ vào pha động để cải thiện hệ số bất đối của pic tạp B. Điều kiện sắc ký thích hợp phải đáp ứng yêu cầu sau: pic tạp B Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 177 có hệ số bất đối AS nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, tách hoàn toàn các pic khác trên sắc ký đồ (kể cả meloxicam) và đạt độ tinh khiết pic ≥ 99%. Điều kiện này cũng thích hợp để định lượng tạp B trong nguyên liệu và chế phẩm meloxicam. Tiêu chuẩn hóa tạp B Tạp B đã được tiêu chuẩn hóa trên các chỉ tiêu: tính chất, định tính và độ tinh khiết. Xây dựng quy trình định lượng tạp B trong nguyên liệu và chế phẩm meloxicam Áp dụng điều kiện sắc ký của quy trình xác định độ tinh khiết tạp B. Do giới hạn cho phép của tạp B trong nguyên liệu meloxicam theo Dược điển Việt Nam IV là 0,1%, một mẫu giả lập đã được chuẩn bị như sau: thủy phân nguyên liệu meloxicam trong dung dịch natri hydroxyd 1M, sau đó điều chỉnh bằng cách thêm chuẩn meloxicam để được dung dịch có tỷ lệ nồng độ của meloxicam và tạp B là 1000:1, lọc qua màng lọc 0,45 µm và tiến hành sắc ký (3). Khảo sát nồng độ đo ở 2 mức: meloxicam 500 µg/ml và tạp B 0,5 µg/ml (dung dịch chuẩn I); meloxicam 1000 µg/ml và tạp B 1 µg/ml (dung dịch chuẩn II). Chọn nồng độ đo thích hợp khi diện tích pic tạp B đủ lớn để đảm bảo tính chính xác và độ đúng của phương pháp, pic meloxicam không quá lớn để đảm bảo cột không bị quá tải. Thẩm định phương pháp Theo hướng dẫn của ICH ban hành tháng 11 năm 2005 (2), bao gồm khảo sát tính phù hợp của hệ thống, tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), độ chính xác và độ đúng. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Tinh chế 5-methylthiazol-2-ylamin (tạp B của meloxicam) Bốn gam 5-methylthiazol-2-ylamin được kết tinh lại trong một lượng tối thiểu methanol nóng, lọc nóng qua giấy lọc và để nguội cho kết tinh, sau đó được lọc dưới áp suất giảm để thu tủa, sấy tủa ở 50oC trong 6 giờ, thu được 3 g sản phẩm tinh chế. Bảng 1 và hình 1 minh họa kết quả kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm tinh chế. Bảng 1: Kết quả xác định nhiệt độ nóng chảy của tạp B sau tinh chế Lần đo Nhiệt độ bắt đầu tan chảy (°C) Nhiệt độ tan chảy hoàn toàn (°C) 1 95 95 2 95 95 3 95 95 Nhận xét: khoảng nhiệt độ từ khi trạng thái rắn bắt đầu tan chảy đến khi tan chảy hoàn toàn của tạp B chênh lệch không quá 1°C, sơ bộ cho thấy tạp B tinh khiết. (1) (2) Hình 1: Sắc ký lớp mỏng kiểm tra độ tinh khiết của tạp B. Sắc ký lớp mỏng: Bản mỏng silica gel 60 F254 (10 x 1,5 cm). Dung môi khai triển Dicloromethan – methanol (20:1) n-hexan – aceton (2:1) Phát hiện: soi dưới đèn UV 254 nm. Thể tích chấm mẫu: 10 µl. Dung dịch thử: dung dịch tạp B 0,01 g/ml methanol. Nhận xét: khi tiến hành sắc ký với 2 hệ dung môi khai triển khác nhau đều chỉ cho một vết duy nhất, không có vết lạ, sơ bộ cho thấy mẫu tạp B tinh khiết. Xây dựng quy trình xác định độ tinh khiết tạp B Hình 2 minh họa sắc ký đồ của mẫu tạp B (mẫu thử) với một số điều kiện sắc ký khảo sát tiêu biểu. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 178 (a) (b) (c) (d) (e) (f) Hình 2: Sắc ký đồ mẫu tạp B với các điều kiện sắc ký khảo sát. Bước sóng phát hiện: 260 nm (bước sóng hấp thụ cực đại dựa vào phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp B). (1): tạp B.(a): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – nước (40:60), 1 ml/phút, 20 µl. (b): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH - isopropanol (40:60), 1 ml/phút, 20 µl. (c): cột Gemini C18 (250 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – TEA 1 mM/nước (pH 10,5) (50:50), 1 ml/phút, 20 µl. (d): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – TEA 0,8 mM/nước (pH 9,7) (50:50), 0,6 ml/phút, 10 µl. (e): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – TEA 0,8 mM/nước (pH 9,7) (50:50), 0,8 ml/phút, 10 µl. (f): cột Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 5 µm), MeOH – TEA 0,8 mM/nước (pH 9,7) (45:55), 0,6 ml/phút, 10 µl. Nhận xét: Điều kiện (a - d): pic tạp B có hệ số đối xứng lớn hơn 1,5. Điều kiện (e): thời gian lưu của tạp B là 3,3 phút, trùng với pic meloxicam. Điều kiện (f): thời gian lưu của tạp B là 5,07 phút, hệ số bất đối AS = 1,2; độ tinh khiết của pic tạp B ≥ 99% (kiểm tra với đầu dò PDA); Đồng thời điều kiện này cũng cho pic tạp B tách hoàn toàn pic meloxicam (hình 3). Hình 3: Sắc ký đồ dung dịch meloxicam 1000 µg/ml và tạp B 1 µg/ml với điều kiện (f) (1) (1) (1) (1) (1) (1) Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 179 Thẩm định phương pháp Bảng 2: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống trên dung dịch tạp B 100 µg/ml (n=6) tR (phút) S (µV x giây) AS RS N Trung bình 5,072 5578731 1,2 8,5 32753 RSD 0,10% 0,38% 1,53% Nhận xét: RSD của thời gian lưu (tR), diện tích pic (S), số đĩa lý thuyết (N) đều không quá 2%, hệ số bất đối (AS) nằm trong khoảng 0,8 – 1,5, độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5. Vậy quy trình phân tích đạt tính phù hợp của hệ thống. Bảng 3: Kết quả khảo sát tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính và độ chính xác Tính đặc hiệu Sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu pha động: không xuất hiện pic tại thời gian lưu của pic tạp B trong sắc ký đồ mẫu thử. Sắc ký đồ mẫu thử: ngoài pic tạp B chỉ có 2 pic lạ có thời gian lưu và phổ UV giống như 2 pic xuất hiện trong sắc ký đồ mẫu trắng, chứng tỏ 2 pic lạ này là của mẫu trắng. Pic tạp B tinh khiết và tách hoàn toàn các pic khác. Khoảng tuyến tính 20 – 200 ppm; y = 54638x; R2 = 0,9998 Độ lặp lại (RSD, n=6) 1,78% Độ chính xác trung gian (RSD, n = 18) 1,70% Nhận xét: Quy trình xác định độ tinh khiết tạp B bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng và độ chính xác cao, do đó có thể áp dụng quy trình để tiến hành xác định độ tinh khiết của tạp B. Bảng 4: Kết quả xác định độ tinh khiết của tạp B (n=6) Khoa Dược, Đại học Y Dược TPHCM Viện Kiểm nghiệm thuốc TPHCM Độ tinh khiết tạp B trên chế phẩm nguyên trạng 99,90% 99,94% Tiêu chuẩn hóa tạp B Việc xây dựng phương pháp kiểm tra chất lượng tạp B được tiến hành trên 3 mẫu sản phẩm tinh chế với các chỉ tiêu được tham khảo theo Dược điển Việt Nam IV. Độ tinh khiết tạp B sẽ được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. Sau khi tiến hành tiêu chuẩn hóa tạp B, dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật tạp B được trình bày trong bảng 5. Bảng 5: Tóm tắt các chỉ tiêu được đề nghị trong dự thảo tiêu chuẩn kỹ thuật tạp B Chỉ tiêu Mức chất lượng đề nghị Tính chất Chất rắn, dạng bột vô định hình màu nâu, mùi hắc. Tan trong methanol, cloroform. Định tính Nhiệt độ nóng chảy 95°C ± 0,5°C Phổ hồng ngoại Phải có số sóng của nhóm –NH (3423 cm-1), C=C (1510 cm-1) Độ tinh khiết Không ít hơn 99,0% tính trên chế phẩm nguyên trạng khi xác định bằng HPLC Xây dựng quy trình định lượng tạp B trong nguyên liệu meloxicam và chế phẩm (a) (b) Hình 4: Sắc ký đồ dung dịch chuẩn I (a) và dung dịch chuẩn II (b). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 180 Hình 4 minh họa sắc ký đồ của dung dịch chuẩn I và II với điều kiện sắc ký tương tự quy trình xác định độ tinh khiết tạp B. Cả 2 dung dịch chuẩn I và II đều có pic tạp B có hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5; độ phân giải giữa meloxicam và pic tạp B lớn hơn 1,5; số đĩa lý thuyết không bị giảm sau các lần tiêm mẫu liên tiếp. Điều này chứng tỏ cột không bị quá tải. Chiều cao pic tạp B trên sắc ký đồ của dung dịch I và II lần lượt là 0,002 AU và 0,005 AU. Để đảm bảo độ đúng và độ chính xác khi đánh giá quy trình, chọn dung dịch II tương ứng với nồng độ đo meloxicam 1000 µg/ml và tạp B 1 µg/ml. Thẩm định phương pháp Bảng 6: Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống (n=6) tR (phút) S AS RS N Mẫu chuẩn Trung bình 5,054 53502 1,2 3,3 30073 RSD 0,19% 1,53% 3,47% Mẫu giả lập Trung bình 5,040 53723 1,2 3,4 31909 RSD 0,34% 1,85% 2,45% Nhận xét: RSD của thời gian lưu (tR), diện tích pic (S) và số đĩa lý thuyết (N) đều không quá 2%, hệ số bất đối (AS) nằm trong khoảng 0,8 – 1,5 và độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5. Vậy quy trình định lượng tạp B trong meloxicam đạt tính phù hợp của hệ thống. Bảng 7: Kết quả khảo sát tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, độ chính xác và độ đúng Tính đặc hiệu Sắc ký đồ mẫu pha động, mẫu trắng không có pic nào xuất hiện tại thời gian lưu tương ứng của pic tạp B trong mẫu chuẩn. Sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu giả lập, mẫu thử thêm chuẩn không xuất hiện pic lạ trùng với pic tạp B, pic tạp B tinh khiết và tách hoàn toàn với pic meloxicam. Phổ UV tại thời gian lưu của pic tạp B trong sắc ký đồ mẫu chuẩn, mẫu giả lập, mẫu thử thêm chuẩn giống nhau. Khoảng tuyến tính 0,8 – 1,2 ppm; y = 52180x; R2 = 0,9960 LOD 0,08 ppm LOQ 0,20 ppm Độ lặp lại (RSD, n=6) 2,01% Độ chính xác trung gian (RSD, n = 18) 3,05% Độ đúng (tỷ lệ hồi phục, n = 9) 99,83% - 104,57% Nhận xét: Quy trình định lượng tạp B trong meloxicam bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, tuyến tính tại khoảng nồng độ đo, có giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp, độ chính xác và độ đúng đáp ứng yêu cầu đề ra(2). Do đó có thể áp dụng quy trình để định lượng tạp B trong nguyên liệu và chế phẩm meloxicam. Ứng dụng quy trình định lượng tạp B trong nguyên liệu và chế phẩm meloxicam Bảng 8: Kết quả định lượng tạp B trong nguyên liệu và chế phẩm meloxicam (n=6) Nơi cung cấp Nồng độ tạp B (ppm) Nguyên liệu meloxicam Công ty cổ phần xuất nhập khẩu Y tế DOMESCO Không phát hiện Chế phẩm Zival Công ty cổ phần sản xuất – thương mại Dược phẩm Đông Nam Nhận xét: nguyên liệu meloxicam và viên nén Zival đạt yêu cầu về giới hạn của tạp chất B theo quy định của Dược điển Việt Nam IV. KẾT LUẬN 5-methylthiazol-2-ylamin đã được tiêu chuẩn hóa để làm chất đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm tạp chất B của meloxicam. Quy trình định lượng tạp B đã được xây dựng, thẩm định và ứng dụng để kiểm tra mẫu nguyên liệu và chế phẩm meloxicam, đều cho kết quả đạt yêu cầu về giới hạn của tạp B theo quy định của Dược điển Việt Nam IV. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 384-386, 390-392. 2. ICH Harmonised Tripartite Guideline (2005), Validation of analytical procedures: text and methodology, 1-5. 3. Ludwig H (2007), Validation and qualification in analytical laboratories – 2nd edition, Taylor & Francis Group, New York, Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 181 142-144, 146-148. 4. Mezei T, Mesterházy N, Bakó T, Porcs-Makkay M, Simig G, Volk B (2009), Manufacture of high-purity meloxicam via its novel potassium salt monohydrate, Organic Process Research & Development, 13:567–572. Ngày nhận bài báo: 10.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 26.12.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014