Xây dựng kỹ thuật Multiplex-PCR sử dụng chung mồi để phát hiện một số tác nhân gây nhiễm khuẩn trong thực phẩm

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 327 XÂY DỰNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR SỬ DỤNG CHUNG MỒI ĐỂ PHÁT HIỆN MỘT SỐ TÁC NHÂN GÂY NHIỄM KHUẨN TRONG THỰC PHẨM Nguyễn Đỗ Phúc*, Hoàng Hoài Phương*, Trần Thị Ngọc Phương*, Phạm Hùng Vân** TÓM TẮT Đặt vấn ñề: Kỹ thuật multiplex-PCR cho phát hiện các tác nhân gây nhiễm khuẩn trong thực phẩm như Listeria monocytogenes, Vibrio choleare và Shigella spp. ñồng thời cùng một lúc nhằm góp phần cho công tác xét nghiệm nhanh phục vụ cho giám sát và ngộ ñộc thực phẩm là một nhu cầu cấp thiết hiện nay. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng bộ kit xét nghiệm multiplex PCR sử dụng chung mồi ñể phát hiện ñồng thời nhiều tác nhân vi sinh gây nhiễm trùng thực phẩm bao gồm: Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp. Phương pháp nghiên cứu: Các chủng vi khuẩn chuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp sau khi tăng sinh trên môi trường TSB ñược sử dụng ñể tách chiết DNA và kỹ thuật multiplex-PCR sử dụng chung mồi ñể phát hiện các tác nhân này. Kết quả nghiên cứu: Trong phản ứng multiplex-PCR sử dụng chung mồi có nồng ñộ Mg2+ là 3,5mM, nồng ñộ các cặp mồi ñể phát hiện các vi khuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp là 2pM và nồng ñộ mồi chung là 5pM cho một phản ứng. - Độ nhạy của bộ kít multiplex-PCR chung mồi, khi phát hiện Listeria monocytogene, Vibrio cholerae, và Shigella spp là 103 vi khuẩn/ml. - Độ ñặc hiệu của bột kít multiplex- PCR là ñặc hiệu với các vi khuẩn ñích Listeria monocytogene, Vibrio cholerae, và Shigella spp và không ñặc hiệu ñối với các vi khuẩn không ñích: Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria seewil, Vibrio parahamolyticus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium và E.coli. Kết luận: Sử dụng phương pháp multiplex-PCR chung mồi ñể phát hiện 3 vi khuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp. gây ô nhiễm thực phẩm cùng một lúc có thể áp dụng tại phòng thử nghiệm vi sinh thực phẩm trong công tác giám sát và ñiều tra một số vi khuẩn gây tiêu chảy do thực phẩm bi ô nhiễm gây nên. Từ khóa: vi khuẩn gây ô nhiễm thực phẩm, multiplex-PCR. ABSTRACT SET UP A TECHNIQUE OF MULTIPLEX-PCR USING THE GENERAL PRIMER FOR DETECTION SOME PATHOGENIC BACTERIA CONTAIMINATION IN FOOD Nguyen Do Phuc, Hoang Hoai Phuong, Tran Thi Ngoc Phuong, Pham Hung Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 327 - 336 Background: The multiplex-PCR for detection of the bacteria contaiminated in food such as Listeria monocytogenes, Vibrio choleare và Shigella spp. at the same time helping for supervise and investigate the food born outbreak is necessary Objectives: Set up a technique of multiplex-PCR using the general primer for detection the pathogenic bacteria: Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, and Shigella spp. Method: The strains of Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae and Shigella spp after enrichment in TSB medium that used for extraction DNA and using technique multiplex-PCR with the general primer for detection those bacterias. Results: In the kit of multiplex-PCR have Mg2+ content is 3.5mM, primer for detection Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, and Shigella spp is 2pM and the general primer is 5pM for one reaction. - The sensitivity of the multiplex-PCR kit for detection Listeria monocytogene, Vibrio cholerae, and Shigella spp is là 103 bacteria/ml. - The specificity of the multiplex-PCR kit can detection of Listeria monocytogene, Vibrio * Viện Vệ sinh - Y tế Công cộng TP Hồ Chí Minh ** Trường Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Liên lạc: Ths. Nguyễn Đỗ Phúc ĐT: 0907 669 008 Email: nguyendophuc@ihph.org.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 328 cholerae, và Shigella spp. but not detection of Listeria innocua, Listeria ivanovii, Listeria seewil, Vibrio parahamolyticus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium và E.coli. Conclusion: Using the technique of multiplex-PCR with the general primer for detection of Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, and Shigella spp. at the same time can apply in microbiological laboratory for supervise and investigate the food born outbreak. Keywords: bacteria contaminated in food, multiplex-PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ Nhờ ñặc ñiểm là kỹ thuật mở, PCR ñang ñược triển khai nghiên cứu và áp dụng ñể phát hiện các tác nhân vi sinh trong các mẫu thử tại nhiều phòng thử nghiệm vi sinh ở trong nước. Do khả năng phát hiện cùng một lúc từ hai loại tác nhân vi sinh trở lên nên multiplex-PCR ñược nhiều nhà nghiên cứu áp dụng trong các phòng thí nghiệm của mình. Tuy nhiên việc áp dụng kỹ thuật multiplex này ñòi hỏi nhà nghiên cứu phải thiết kế các ñoạn mồi sao cho sản phẩm khuyếch ñại phải có các kích thước khác nhau, và quan trọng nhất là phải khắc phục ñược một trở ngại chính là tránh không cho các mồi ñược bắt cặp lẫn nhau làm giảm hiệu quả khuếch ñại của PCR. Thông thường ñể khắc phục ñược trở ngại này thì các nhà nghiên cứu phải thiết kế mồi sao cho không có dimer xảy ra giữa các mồi và của chính mồi với nhau và việc thiết kế này sẽ không dễ dàng. Để khắc phục tình trạng trên, giải pháp kỹ thuật ñược nghiên cứu trong ñề tài này là kỹ thuật multiplex-PCR sử dụng chung mồi. Nguyên tắc của tiếp cận này là sử dụng một hệ thống các mồi ñặc hiệu ở hàm lượng rất thấp trong PCR mix ñể làm ñiều kiện giúp cho một cặp mồi chung khuếch ñại ñược các ñọan DNA ñặc hiệu cho các gene mục tiêu của các vi khuẩn ñích và sản phẩm khuếch ñại này sẽ có kích thước khác biệt nhau ñể phân biệt ñược vi khuẩn gây bệnh có trong mẫu thử là vi khuẩn nào. Mục tiêu nghiên cứu - Tối ưu các ñiều kiện cho multiplex PCR sử dụng chung mồi: nồng ñộ mồi, nồng ñộ Mg2+. - Thử nghiệm ñộ nhạy và ñộ ñặc hiệu của bộ kit trên canh khuẩn chủng chuẩn. - Thử nghiệm so sánh khả năng phát hiện Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp trong thực phẩm bằng hai phương pháp multiplex-PCR sử dụng chung mồi và phương pháp nuôi cấy truyền thống. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - Vi khuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp - Cặp mồi ñặc hiệu có kí hiệu: MLP-Sh1-MLP- Sh2 (phát hiện Shigella spp.); MLP-CTX2-MLP- CTX3 (phát hiện Vibrio cholerae); MLP-List F1- MLP-List R1 (phát hiện Listeria monocytogenes); KY78 -KY80 (mồi khuyếch ñại chung). - Mater Mix 2 X: 100 Mix: PCR buffer 10x: 500µl; MgCl2 50 mM: 350- 450µl (khảo sát hai nồng ñộ: 3,5mM và 4,5mM); dNTP: 40µl; Taq polymerase: 25µl; dH2O:1785µl; Tổng thể tích 2500µl. - Đệm TE: 10mM Tris-HCl (pH 8), 1 mM EDTA. - Đệm PCR 10X có thành phần như sau: 500mM KCl, 15mM MgCl2, 100mM Tris-HCl, pH 9, bảo quản ở nhiệt ñộ phòng. Phương pháp nghiên cứu - Qui trình multiplex-PCR chung mồi: bao gồm tách chiết DNA bằng InstaGene, sử dụng 5µl dịch chiết DNA cho vào 20µl master mix PCR và khuếch ñại DNA theo chu trình nhiệt 1: 40 chu kỳ với ba bước nhiệt ñộ: 940C/30giây; 550C/30 giây và 720C/60 giây. Chu kỳ 2: 720C/10 phút và giữ 40C. Sản phẩm PCR bảo quản trong -20oC cho ñến khi ñiện di. Sản phẩm sau phản ứng PCR ñược ñiện di trên gel agarose 2% có bổ sung ethidium bromide 4µl (dung dịch ethidium bromide 5mg/ml). Điện di ở ñiện thế 135V trong 25 phút. Sau ñó quan sát kết quả trên máy chụp hình ñiện di bằng tia UV có bước sóng 312nm. Nếu xuất hiện các vạch có chiều dài: + 280bp: là sản phẩm PCR phát hiện Listeria monocytogenes + 600bp: là sản phẩm PCR phát hiện Vibrio cholerae + 380bp: là sản phẩm PCR phát hiện Shigella - Pha chế bộ kit thử multiplex-PCR với 12 tổ hợp thành phần khác nhau với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM, 4,5mM với các nồng ñộ mồi riêng cho từng loại vi khuẩn và mồi chung với tỷ lệ 2-5. - Thử nghiệm khảo sát sát nồng ñộ Mg2+ và nồng ñộ mồi: Chuẩn bị vi khuẩn Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, và Shigella spp. trên canh khuẩn TSB sau 24 giờ nuôi cấy ñể tách chiết DNA. - Thử nghiệm ñộ nhạy và ñộc ñặc hiệu Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 329 + Thử ñộ nhạy trên chủng chứng Thử nghiệm ñộ nhạy với 3 chủng vi khuẩn (Listeria monocytogenes,Vibrip cholerae, Shigella spp.) với các nồng ñộ 107,106,105,104,103,102,101 và 100 vi khuẩn/ml trên chủng chứng. Sử dụng các nồng ñộ vi khuẩn trên ñể tách chiết DNA và ñưa vào phản ứng multiplex-PCR. Thử ñộ ñặc hiệu trên chủng không phải ñích Các vi khuẩn không ñích cho Listeria monocytogenes bao gồm Listeria inocua, Listeria ivanovii và Listeria seewil, cho Vibrio choleare là Vibrio parahaemolyticus và cho Shigella spp. là Salmonella và E. coli. Nuôi cấy vi khuẩn không phải mục tiêu này trên môi trường nuôi cấy tăng sinh TSB, qua ñêm (16giờ). Nồng ñộ vi khuẩn ước khoảng 108 CFU/ml. Pha loãng canh khuẩn theo ñộ pha loãng bậc 10 với ñệm phosphate, sử dụng nồng vi khuẩn ñã khảo sát về ñộ ñặc hiệu. Sử dụng các nồng ñộ vi khuẩn trên ñể chiết tách DNA, và thực hiện phản ứng PCR. - Thử nghiệm so sánh khả năng phát hiện Listeria monocytogenes,Vibrip cholerae, Shigella spp. bằng phương pháp multiplex-PCR chung mồi và phương pháp nuôi cấy truyền thống. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Khảo sát nồng ñộ Mg2+ với nồng ñộ các mồi khác nhau Thử nghiệm qui trình multiplex-PCR chung mồi với 2 nồng ñộ Mg2+: 3,5mM và 4,5mM ñược thử với các cặp mồi phát hiện Listeria monocytogenes, và Vibrio cholerae Shigella spp. cho phản ứng multiplex- PCR, với nồng ñộ mồi chung 5pM và mồi riêng là 2pM theo bố trí thử nghiệm với 12 tổ hợp khác nhau master mix khác nhau. Kết quả khảo sát về nồng ñộ Mg 2+ và nồng ñộ các cặp mồi chung, mồi ñặc hiệu cho từng vi khuẩn trình bày ở hình 1, 2 và 3. Kết quả thử nghiệm phát hiện Listeria monocytogenes với 12 tổ hợp maxter mix khác nhau . Hình 1. Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ và nồng ñộ mồi thích hợp của cặp mồi chung và mồi ñặc hiệu ñể phát hiện Listeria monocytognes Qua kết quả hình 1, với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM và nồng ñộ cặp mồi chung là 5pM và các cặp mồi ñặc hiệu ñể phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. là 2pM cho một phản ứng PCR ñược sử dụng ñể phát hiện chủng chứng (+) Listeria monpcytognes, trên hình 1 vạch ñiện di ở vị trí 1L sáng, rõ và không có các không xuất hiện nhiều vạch trắng sáng do primer thừa so với các vạch ñiện di ở các vạch ñiện di từ 2L cho ñến 12L (ñó là tổ hợp 12 maxter mix khác nhau). Kết quả thử nghiệm phát hiện Vibrio cholerae với 12 tổ hợp maxter mix khác nhau Hình 2. Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ và nồng ñộ mồi thích hợp của cặp mồi chung và mồi ñặc hiệu ñể phát hiện Vibrio cholerae Qua kết quả hình 2, với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM và nồng ñộ cặp mồi chung là 5pM và các cặp mồi ñặc hiệu ñể phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. là 2pM cho một phản ứng PCR ñược sử dụng ñể phát hiện chủng chứng (+) Vibrio cholerae trên hình 2 vạch ñiện di ở vị trí 1L sáng, rõ và không có các không xuất hiện nhiều vạch trắng sáng do primer thừa so với các vạch ñiện di ở các vạch ñiện di từ 2L cho ñến 12L (ñó là tổ hợp 12 maxter mix khác nhau). Qua kết quả hình 3, với nồng ñộ Mg2+ 3,5mM và nồng ñộ cặp mồi chung là 5pM và các cặp mồi ñặc hiệu 600bp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 330 ñể phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. là 2pM cho một phản ứng PCR ñược sử dụng ñể phát hiện chủng chứng (+) Shigella spp. trên hình 3 vạch ñiện di ở vị trí 1L sáng, rõ và không có các không xuất hiện nhiều vạch trắng sáng do primer thừa so với các vạch ñiện di ở các vạch ñiện di từ 2L cho ñến 12L (ñó là tổ hợp 12 maxter mix khác nhau). Như vậy qua kết quả khảo sát trên, bộ kít thử phát hiện Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. với các thành phần một phản ứng multiplex-PCR có nồng ñộ Mg2+ là 3,5mM, nồng ñộ mồi chung là 5pM, nồng ñộ mồi ñặc hiệu cho Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp. mỗi loại là 2pM cho một phản ứng. - Thử nghiệm ñộ nhạy của bộ kít với các vi khuẩn ñích Thử nghiệm ñộ nhạy với 3 chủng vi khuẩn (Listeria monpcytognes, Vibrio choleare và Shiggella spp.) với các nồng ñộ 107,106,105,104,103,102,101 và 100 tế bào vi khuẩn/ml. Kết quả thử nghiệm phát hiện Shigella spp. với 12 tổ hợp maxter mix khác nhau Hình 3. Kết quả khảo sát nồng ñộ Mg2+ và nồng ñộ mồi thích hợp của cặp mồi chung và mồi ñặc hiệu ñể phát hiện Shigella spp. Hình 4. Kết quả khảo sát ñộ nhạy của bộ kít với các nồng ñộ Listeria monocytogenes khác nhau Vạch 280bp: Listeria monocytogenes; Vạch 500bp: chứng nội tại + Kết quả ñộ nhạy trên canh khuẩn Listeria monocytogenes Chủng Listeria monocytogenes trên canh khuẩn thuần ñược pha thành các nồng ñộ vi khuẩn tương ñương ở giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 có nồng ñộ Listeria monocytogenes lần lượt là 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 CFU/ml, từ các nồng ñộ này ñem chiết tách DNA và cho vào phản ứng multiplex-PCR chung mồi ñể phát hiện Listeria monocytogenes. Kết quả trình bày ở hình 4. Qua kết quả trên hình 4, cho thấy ở giếng 1, 2, 3, 4, có nồng ñộ Listeria monocytogenes lần lượt là 106, 105, 104, 103 CFU/ml khi ñưa vào phản ứng multiplex PCR chung mồi mới có thể phát hiện ñược Listeria monocytogenes. Như vậy nồng ñộ vi khuẩn Listeria monocytogenes sau khi tăng sinh tối thiểu là 103 vi khuẩn/ml thì bộ kít mới có thể phát hiện ñược. Kết quả ñộ nhạy trên canh khuẩn Vibrio cholerae Chủng Vibrio cholerae trên canh khuẩn thuần ñược pha thành các nồng ñộ vi khuẩn tương 380bp 380bp 500bp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 331 ñương ở giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, có nồng ñộ Vibrio cholerae lần lượt là 106, 105, 104, 103, 102, 101 CFU/ml, từ các nồng ñộ này ñem chiết tách DNA và cho vào phản ứng multiplex-PCR chung mồi ñể phát hiện Vibrio cholerae. Kết quả trình bày ở hình 5. Qua kết quả trên hình 5, cho thấy ở giếng 1, 2, 3, 4, có nồng ñộ Vibrio cholerae lần lượt là 106, 105, 104, 103 vi khuẩn/ml khi ñưa vào phản ứng multiplex PCR chung mồi mới có thể phát hiện ñược Vibrio cholerae. Như vậy nồng ñộ vi khuẩn Vibrio cholerae sau khi tăng sinh tối thiểu là 103 vi khuẩn/ml bộ kít mới có thể phát hiện ñược. Hình 5. Kết quả khảo sát ñộ nhạy của bộ kít với các nồng ñộ Vibrio cholerae khác nhau Vạch 600bp: Vibrio cholerae; Vạch 500bp: chứng nội tại Hình 6. Kết quả khảo sát ñộ nhạy của bộ kít với các nồng ñộ Shigella spp. khác nhau Vạch 380bp: Shigella spp.; Vạch 500bp: chứng nội tại Kết quả ñộ nhạy trên canh khuẩn Shigella spp. Chủng Shigella spp. trên canh khuẩn thuần ñược pha thành các nồng ñộ vi khuẩn tương ñương ở giếng 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 có nồng ñộ Shigella spp. lần lượt là 106, 105, 104, 103, 102, 101, 100 CFU/ml, từ các nồng ñộ này ñem chiết tách DNA và cho vào phản ứng multiplex-PCR chung mồi ñể phát hiện Shigella spp. Kết quả trình bày ở hình 6.Qua kết quả trên hình 6, cho thấy ở giếng 1, 2, 3, 4, có nồng ñộ Shigella spp. lần lượt là 106, 105, 104, 103 vi khuẩn/ml khi ñưa vào phản ứng multiplex PCR chung mồi mới có thể phát hiện ñược Shigella spp. Như vậy nồng ñộ vi khuẩn Shigella spp. sau khi tăng sinh tối thiểu là 103 CFU/ml bộ kít mới có thể phát hiện ñược. Thử nghiệm ñộ ñặc hiệu trên canh khuẩn chủng không phải ñích Thử nghiệm ñộ ñặc hiệu của bột kít multiplex- PCR chung mồi cho các vi khuẩn cùng giống nhưng khác loài ñối với các vi khuẩn ñích ñể xác ñịnh ñộ ñặc hiệu của bộ kít. Nuôi cấy vi khuẩn không phải mục tiêu này trên môi trường nuôi cấy tăng sinh (BHI), qua ñêm (16hr). Nồng ñộ vi khuẩn ước khoảng 108 CFU/ml. Pha loãng canh khuẩn theo ñộ pha loãng bậc 10 với ñệm phosphate, ñến mức ñộ giới hạn phát hiện của bộ kít,sau ñó chiết tách DNA, và thực hiện phản ứng PCR. Kết quả ñộ ñặc hiệu Listeria monocytogenes trên canh khuẩn các vi khuẩn không ñích Các vi khuẩn không ñích của Listeria monocytogenes là các chủng Listeria innocua, Listeria ivanovii và Listeria seewil ñược ñưa vào thử nghiệm ñộ ñặc hiệu của bộ kít. Kết quả trình bày hình 600bp 500bp 380bp 500bp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 332 7. Qua kết quả hình 7, cho thấy ở các giếng số 1, số 2, số 3 và số 4, các vi khuẩn cùng giống Listeria spp. thì không có các vạch của Listeria monocytogenes. Giếng số 5, khi phối hợp 3 chủng của Listeria spp., trong ñó có Listeria monocytogenes thì có xuất hiện vạch tương ứng là 280bp. Điều này chứng tỏ bộ kít chỉ ñặc hiệu cho phát hiện Listeria monocytogenes. Hình 7. Kết quả khảo sát ñộ ñặc hiệu của Listeria monocytognes của bộ kít với các vi khuẩn không ñích Vạch 280 bp: Listeria monocytogenes; Vạch 500bp: chứng nội tại; Giếng 1: Listeria innocua; Giếng 2: Listeria ivanovii; Giếng 3: Listeria innocua + Lis.ivanovii; Giếng 4: Listeria seewil; Giếng 5: Listeria innocua + Listeria ivanovii + Listeria monocytogenes + Listeria seewil Hình 8. Kết quả khảo sát ñộ ñặc hiệu của Shigella spp. của bộ kít với các vi khuẩn không ñích Vạch 380 bp: Shigella spp.; Vạch 500bp: chứng nội tại Giếng 1: Salmonella enteritidis,; Giếng 2: Salmonella typhymurium; Giếng 3: và E.coli; Giếng 4: Shigella spp. và E.coli;Giếng 5: Shigella spp. và Salmonella typhy. + Kết quả ñộ ñặc hiệu Shigella spp. trên canh khuẩn không phải ñích Các vi khuẩn không ñích của Shigella spp. là các chủng Salmonella enteritidis, Salmonella typhymurium và E.coli ñược ñưa vào thử nghiệm ñộ ñặc hiệu của bộ kít. Kết quả trình bày hình 8. Qua kết quả hình 8, cho thấy ở các giếng số 1, số 2, số 3 và số 4, các vi khuẩn cùng giống Shigella spp. thì không có các vạch của Shigella spp. Giếng số 4 và 5, khi phối hợp với chủng Shigella spp. thì có xuất hiện vạch tương ứng là 380bp. Điều này chứng tỏ bộ kít chỉ ñặc hiệu cho phát hiện Shigella spp. + Kết quả ñộ ñặc hiệu Vibrio cholerae trên canh khuẩn không phải ñích Vi khuẩn không ñích của Vibrio cholerae là chủng Vibrio parahaemolyticus ñược ñưa vào thử nghiệm ñộ ñặc hiệu của bộ kít. Kết quả trình bày hình 9. Qua kết quả hình 9, cho thấy ở các giếng số 1, là Vibrio parahaemolyticus, không có vạch của vi khuẩn Vibrio cholerae (600bp). Giếng số 2, là giếng của Vibrio cholerae và giếng số 3 là khi phối hợp với chủng Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus thì có xuất hiện vạch tương ứng là 600bp. Điều này chứng tỏ bộ kít chỉ ñặc hiệu cho phát hiện Vibrio cholerae. 280bp 500bp 500bp 380bp Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 333 Hình 9. Kết quả khảo sát ñộ ñặc hiệu của Vibrio cholerae của bộ kít với các vi khuẩn không ñích Vạch 500bp: chứng nội tại; Vạch 600bp: Vibrio cholerae Giếng 1: Vibrio parahaemolyticus; Giếng 2: Vibrio cholerae; Giếng 3: Vibrio cholerae và Vibrio parahaemolyticus. + Kết quả thử nghiệm với 3 chủng vi khuẩn ñích phát hiện ñồng thời cùng một phản ứng PCR Để xem xét khả năng bộ kít có thể phát hiện ñồng thời cùng một lúc 3 loại vi khuẩn ñích hay không, 3 loại vi khuẩn ñích Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae và Shigella spp. ñược ñưa vào tách chiết DNA cùng một lúc và ñưa vào phản ứng multiplex-PCR, kết quả trình bày hình 10. Thử nghiệm so sánh khả năng phát hiệm vi khuẩn trong thực phẩm bằng hai phương pháp multiplex-PCR chung mồi với phương pháp nuôi cấy truyền thống Sử dụng bộ kít multiplex-PCR chung mồi ñể phát hiện 3 vi khuẩn ñích là Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae và Shigella spp. ñể phân tích các mẫu trong thực tế. Các mẫu thực phẩm ñược lấy từ chương trình giám sát thực phẩm trong các vụ dịch tại Huyện An Phú, An Giang. Tổng số mẫu 2 ñợt giám sát là 22 mẫu, trong ñó bao gốm: 9 mẫu hải sản và 13 mẫu rau các loại. Các mẫu thực phẩm ñược tăng sinh trên môi trường TSB, dịch sau tăng sinh ñược ñem phân tích với bộ kít multiplex-PCR và nuôi cấy truyền thống ñể xác ñịnh các vi khuẩn ñích cần tìm. Kết quả ñược trình bày ở hình 11 và bảng 1. Hình 10. Kết quả khảo sát ñộ ñặc hiệu của 3 vi khuẩn ñích Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae và Shigella spp. cùng trên một phản ứng multiplex-PCR Vạch 280 bp: Listeria monocytogenes; Vạch 380 bp: Shigella spp.; Vạch 500bp: chứng nội tại; Vạch 600bp: Vibrio cholerae Giếng 1: Listeria monocytogenes; Giếng 2: Shigella spp.; Giếng 3: Vibrio cholerae;Giếng 4: Listeria monocytogenes+ Vibrio cholerae+ Shigella spp. 500bp 600bp 280bp 380bp 500bp 600bp 500 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 334 (a) (b) Hình 11. Kết quả ñiện di phát hiện các vi khuẩn ñích của bộ kít multiplex-PCR trong việc giám sát mẫu thực phẩm Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 335 Bảng 1. Kết quả so sánh khả năng phát hiện các vi khuẩn ñích Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae và Shigella spp bằng phương pháp multiplex-PCR và nuôi cấy TT Tên mẫu Địa ñiểm Multiplex-PCR chung mồi Nuôi cấy truyền thống Số mẫu ñợt 1 (hình ñiện di a) 1 Cá cơm sông Chợ Bắc Đai, xã Nhơn Hội - - 2 Cá thểu -nt- - - 3 Ốc bươu -nt- - - 4 Cá tổng hợp các loại -nt- - - 5 Rau nhút -nt- - - 6 Rau xanh các loại Chợ Long Bình, TT Long Bình - - 7 Giá - chuối - rau muống -nt- - - 8 Rau nhút -nt- - - 9 Tép Chợ Khánh An, xã Khánh An - - 10 Rau nhút -nt- - - Số mẫu ñợt 2 (hình ñiện di b) 1 Rau cần Xã Nhơn Hội - - 2 Ngò gai -nt- - - 3 Rau nhút Xã Khánh An - - 4 Kinh giới -nt- - - 5 Rau ñắng -nt- - - 6 Rau răm -nt- - - 7 Xà lách -nt- - - 8 Xà lách lá to -nt- - - 9 Cá chạch Xã Nhơn Hội - - 10 Cá linh Xã Khánh An - - 11 Hến -nt- - - 12 Hến -nt- - - Tổng số 22 mẫu thực phẩm gồm 2 nhóm thực phẩm ñược lấy mẫu trong chương trình giám sát các bệnh gây tiêu chảy tại Huyện An Phú, An Giang, ñem phân tích khả năng phát hiện Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae và Shigella sp bằng phương pháp multiplex-PCR chung mồi và phương pháp nuôi cấy truyền thống ñều không phát hiện ñược các vi khuẩn cần tìm, ñiều này cho thấy không có sự khác biệt giữa hai phương pháp phân tích, có thể ứng dụng phương pháp multiplex-PCR trong phân tích phát hiện nhanh Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae và Shigella spp trong thực phẩm. KẾT LUẬN - Đã khảo sát ñược nồng ñộ Mg2+ là 3,5mM và nồng ñộ cặp mồi chung là 5pM và nồng ñộ các nồng ñộ mồi ñặc hiệu 2pM trong bộ kít thử multiplex-PCR sử dụng chung mồi ñể phát hiện Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae và Shigella spp. - Độ nhạy của bộ kít khi phát hiện các vi khuẩn ñích trên canh khuẩn thuần và gây nhiễm trên thực phẩm: Chủng chuẩn Độ nhạy trên chủng chứng (vi khuẩn/ml) Độ ñặc hiệu L. monocytogenes 103 Đặc hiệu Vibrio cholerae 103 Đặc hiệu Shigella spp 103 Đặc hiệu - Khảo sát 22 mẫu giám sát thực tế bằng hai phương pháp multiplex-PCR chung mồi và phương pháp nuôi cấy truyền thống cho kết quả tương tự. Các mẫu ñều không phát hiện có sự hiện diện của Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae và Shigella spp. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 336 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục thực hiện ñề tài với quy mô lớn hơn về số lượng mẫu, chủng loại mẫu và ñịa ñiểm lấy mẫu ñể bổ sung cho việc ñánh giá ñầy ñủ cho bộ kít. - Khảo sát một số qui trình tách chiết DNA thích hợp ñể thu ñược DNA hiệu quả cho phản ứng PCR. trên nhiều nền mẫu thực phẩm khác nhau. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Alison d. O'brien and Randall k. Holmes (1987). Shiga and Shiga-Like Toxins. Microbiological Reviews, Vol. 51, No. 2 June, p. 206- 220. 2. Brasher CW., DePaola A, Jones DD., Bej AK. (1998). Detection of Microbial Pathogens in Shellfish with Multiplex PCR. Current microbiology vol. 37, pp. 101–107. 3. Castroverde CDM., San Luis BB., Monsalud RG., and Hedreyda CT. (2006). Differential detection of vibrios pathogenic to shrimp by multiplex PCR. J. Gen. Appl. Microbiol., 52, 273–280 4. Chen Y and Knabel SJ. (2007): Multiplex PCR for Simultaneous Detection of Bacteria of the Genu Listeria, Listeria monocytogenes, and Major Serotypes and Epidemic Clones of L. monocytogenes. Applied And Environmental Microbiology, Oct. Vol. 73, No. 19: 6299–6304. 5. Espineira M, Atanassova M, Vieites JM., Santaclara FJ. (2010): Validation of a method for the detection of five species, serogroups, biotypes and virulence factors of Vibrio by multiplex PCR in fish and seafood. Food Microbiology 27: 122–131 6. McLauchlina J., Mitchell R.T., Smerdonc W.J., Jewell K. (2004). Listeria monocytogenes and listeriosis: a review of hazard characterisation for use in microbiological risk assessment of foods. International Journal of Food Microbiology 92: 15– 33. 7. Olsen JE (2000). DNA-based methods for detection of food-borne bacterial pathogens. Food Research International 33: 257 – 266. 8. Panicker G, Call DR., Krug MJ., and Bej AK. (2004). Detection of Pathogenic Vibrio spp. in Shellfish by Using Multiplex PCR and DNA Microarrays. Applied And Environmental Microbiology, Dec., p. 7436–7444. 9. Persing DH, Smith TF., Tenover FC., White TF. (1993), PCR detection of Toxin genes in strains of Vibrio cholerae O1 - Diagnotic molecular microbiology principles and applications, Amarican society for Microbiology, 266-270