Xây dựng quy trình định lượng acid amin trong chế phẩm từ nhung hươu (cornu cervi sp.)

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 203 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƯỢNG ACID AMIN TRONG CHẾ PHẨM TỪ NHUNG HƯƠU (Cornu Cervi sp.) Nguyễn Thị Diệu*, Vĩnh Định* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Viện Y Dược Học Dân Tộc TP.Hồ Chí Minh gần đây đã sử dụng Nhung hươu để sản xuất một chế phẩm đáp ứng nhu cầu điều trị, được thị trường trong nước tín nhiệm. Tuy đây là vị thuốc kinh điển, nhưng đã được cải tiến dạng bào chế, sử dụng dưới dạng viên nang và để nâng cao chất lượng thuốc, đề tài được thực hiện với mục tiêu sau: - Khảo sát các kỹ thuật phân tích acid amin ứng dụng vào xác định acid amin trong nhung hươu. - Xác định dấu ấn trên sắc ký đồ dấu vân tay (Finger print) của thành phần acid amin trong nhung hươu tươi và khô để phân biệt với các sản phẩm nhung hươu không tự nhiên.- Tối ưu hóa qui trình định lượng acid amin trên các mẫu nhung hươu tươi, khô, bột và chế phẩm viên nang. Đối tượng & Phương pháp: - Viên nang Nhung hươu chứa 500 mg bột khô nhung hươu của Viện YDHDT. - Các acid amin (AA) chuẩn (12 AA) và chuẩn nội 3-Nitro-L-tyrosin. - Khảo sát thời gian thủy phân protein thành acid amin.- Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các acid amin bằng SKLHNC Kết quả: - Chọn thời gian thủy phân protein thành AA là 24 h. - Định tính bằng phản ứng hóa học: có α- AA (Tyr, Arg) và AA vòng; bằng sắc ký lớp mỏng (SKLM): phát hiện 7 AA và 5 AA chưa biết, xem như dấu vân tay để định tính AA; bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (SKLHNC): tách được 10 AA là Ala, Arg, Gly, Ile, Leu, Lys, Phe, Pro, Ser, Val. - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời 6 AA bằng SKLHNC với: + Điều kiện sắc ký: Máy SKLHNC Alliance Water 2695; đầu dò PDA Waters 2996; cột Xterra, RP 18 (4,6 x 250 mm; 5 µm); to cột: 40 oC; Vtiêm: 20 il; tốc độ dòng: 1 ml/phút; λ: 460 nm; pha động: Đệm Natri acetat 25 mM (pH 6,5) chứa 4% DMF (A), Acetonitril (B), chương trình gradient dung môi. + Chuẩn bị các dung dịch: DABS-Cl 4 mM; đệm Natri acetat 25 mM (pH 6,5) chứa 4% DMF; Nitro-tyrosin (nội chuẩn)141,5 ig/ml trong HCl 0,001 N; hỗn hợp chuẩn 6 acid amin trong dung dịch HCl 0,001 N có nồng độ tương tự mẫu cần phân tích: Serin 34,4 ig/ml, Glycin 172,9 ig/ml, Alanin 142,9 ig/ml, Valin 37,5 ig/ml, Leucin 48,7 ig/ml, Phenylalanin 90,6 ig/ml; mẫu thử: hòa cắn thủy phân 24 h với HCl 0,001 N thành 10 ml, lọc, lấy 5 ml pha loãng với nước cất thành 10 ml + Phản ứng tạo dẫn chất: 125 il mẫu chuẩn (thử), 125 il nội chuẩn, 250 il đệm NaHCp3 100 mM (pH 8,3), 1 ml DABS-Cl 4 mM. Lắc rung nhanh, ủ từ 70 – 72 oC / 12 phút. Để nguội. Thêm 3,5 ml Na2HPp4 50 mM (pH 7,0): EtpH (1:1), lắc rung 30 giây, lọc qua màng lọc 0,45 im. + Đánh giá quy trình phân tích: tính tương tích hệ thống, tính đặc hiệu, độ lặp lại, khoảng tuyến tính, độ đúng: đạt yêu cầu (RSD < 2%). + Áp dụng định lượng 3 lô viên nang Nhung hươu: 010111, 020411 và 030711. Chỉ tiêu khác: tính chất; độ đồng đều khối lượng, mất khối lượng do làm khô, độ rã, độ nhiễm khuẩn. - TCCS đề nghị: tính chất; độ đồng đều khối lượng: KLTB ± 7,5%; mất khối lượng do làm khô: ≤ 5%, độ rã ≤ 30 phút; định tính AA bằng pưhh, SKLM và SKLHNC; định lượng (mg/viên): Ser (≥ 0,33), Gly (≥ 1,73), Ala (≥ 1,43), Val (≥ 0,38), Leu (≥ 0,47) và Phe (≥ 0,88); độ nhiễm khuẩn (DĐVN IV) Kết luận: Đã chiết xuất, thủy phân và xác định được thời gian thủy phân protein; định tính được AA bằng phản ứng hóa học, SKLM (dấu vân tay) và SKLHNC; xây dựng và đánh giá được quy trình xác định đồng thời 6 AA với kỹ thuật tạo dẫn chất tiền cột với thuốc thử DABS-Cl; ứng dụng định lượng 3 lô viên nang Nhung hươu; khảo sát các chỉ tiêu khác và đã góp phần xây dựng tiêu chuẩn cơ sở cho chế phẩm. Từ khóa: nhung hươu, thủy phân protein, acid amin, DABS-Cl. * Khoa Dược, Đại học Y Dược TP. Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS.TS. Vĩnh Định ĐT: 0903639586 Email: npvdinh@yahoo.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 204 ABSTRACT DEVELpPING A QUANTITATIpN METHpD pF AMINp ACIDS FRpM CERF VELVET Nguyen Thi Dieu, Vinh Dinh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 18 - Supplement of No 2 - 2014: 203 - 208 Introduction: Cerf velvet is a high value drug which was classified the second one in the four drugs of traditional medicine as Ginseng – Velvet – Cinnamon - Aconite. Traditional Medicine Institute of Ho Chi Minh city recently used Cerf velvet for production of Cerf velvet capsules. To improve product quality for registration of drugs and to meet the treatment needs at Institute, this study was done with the goal " Developing a quantitation method of amino acids from Cerf velvet”. Materials and methods: - Chemicals: Acetonitrile (HPLC); sodium acetate (Merck), DMF (Merck), 3- Nitro-L-tyrosine (Sigma Aldrich), DABS-Cl (Fluka); 12 amino acids (AA) standard (Drug Quality control Institute Centre). - Materials: Cerf Velvet capsules containing 500 mg dry powder of Cerf velvet of the Institute. - Determination the time of protein hydrolysis by TLC and HPLC: weigh accurately 10 g of the powder and extract completely protein by Soxhlet with EtpH 75%, evaporate to 10 ml extract; hydrolyse with 0.5% phenol / 6 M HCl at 110 °C in 6 h, 12 h, 18 h, 24 h and 30 h, evaporate to dryness. - Qualifying AA by specific reactions, TLC and HPLC. - Developing a method for simultaneously assay of 6 AA in Cerf Velvet capsules by HPLC. Results and discussion: - The time for protein hydrolysis is 24 h. - Determinated α-AA in Cerf Velvet capsules as Tyr, Arg and aromatic acid amins; by TLC determinated 7 AA and 5 unknown acid amins and this method seems as a fingerprint chromatography to identify the AA in samples; by SKLHNC determinated 10 AA. - Developed an SKLHNC method to simultaneously assay 6 AA in Cerf velvet capsules with conditions such as: + Static phase: Xterra RP 18 (4.6 x 250 mm; 5 im); Column temp.: 40 °C; Injection volume: 20 il; Flow rate: 1 ml/min; PDA detector set at 460 nm; Mobile phase is a mixture of acetonitrile and buffer (4% DMF/25 mM sodium acetate, pH 6.5) was run in gradient program. + Stock solution: 3-Nitro-L-tyrosine (IS) 141.5 ig/ml in 0.001 N HCl; mixed of 6 AA standard in 0.001 N HCl with similar concentrations of samples to be analyzed: 34.4 ig/ml Ser, 172.9 ig/ml Gly, 142.9 ig/ml Ala, 37.5 ig/ml Val, 48.7 ig/ml Leu, 90.6 ig/ml Phe; Samples: dissolve the hydrolyzed residue of 24 h in 0.001 N HCl, transfer to a 10 ml volumetric flask, and filter. Transfer accuratery 5 ml of the filtrate to a 10 ml volumetric flask, diluted with distilled water to volume. + Derivatizing condition: 125 il AA standard (sample) solution, 125 il IS, 250 il 100 mM NaHCp3 buffer, pH 8.3 and 1 ml 4 mM DABS-Cl. Lắc rung quickly, incubated at 70 to 72 oC / 12 min, cooled. Add 3.5 ml 50 mM Na2HPp4, pH 7.0: EtpH (1:1), lắc rung 30 sec, filtered through a 0.45 im filter. + Validated the SKLHNC method: the system compatibility, specificity, repeatability, linear range, accuracy were conformed (RSD < 2%). + Applied to assay three lots of Cerf velvet capsules: 010111, 020411 and 030711. + pther criteria: Characteristics; Mass uniformity; Loss of weight; Disintegration time; Microbiological contamination. - In-house specification is proposed such as: Characteristics; Mass uniformity: average mass ± 7.5%; Loss of weight ≤ 5%, Disintegration time ≤ 30 min; determine AA by CR, TLC and SKLHNC; Assay (mg/capsule): Ser ≥ 0.33, Gly ≥ 1.73, Ala ≥ 1.43, Val ≥ 0.38, Leu ≥ 0.47 và Phe ≥ 0.88; Microbiological contamination (Vietnamese Pharmacopoeria, 2009). Conclusion: Protein in Cerf velvet has been extracted, hydrolyzed and the time to hydrolyse protein was 24 h; identified AA by CR, TLC (as a fingerprint TLC) and by SKLHNC; Developed an SKLHNC method to simultaneously assay 6 AA using offline derivatisation technical with DABS-Cl reagent, the method was rapid, accurate and precise; Assayed 3 lots Cerf velvet capsules; pther criteria; Contributed to develop an in-house specification for Cerf velvet capsules Keywords: Cerf velvet, Cornu cervi. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 204 ĐẶT VẤN ĐỀ Nhung hươu là một vị thuốc quý đứng thứ hai sau Nhân sâm trong tứ bảo dược của Y học cổ truyền là Sâm-Nhung-Quế-Phụ, có tác dụng tăng sức đề kháng của cơ thể, giảm sự mệt mỏi, nâng cao sức làm việc. Nhung hươu đã được sử dụng để sản xuất chế phẩm để đáp ứng nhu cầu điều trị ở thị trường trong nước. Nhằm nâng cao chất lượng thuốc làm cơ sở để đăng ký và đáp ứng nhu cầu điều trị bệnh nhân, đề tài này được thực hiện với mục tiêu sau: - Khảo sát và xác định thời gian thủy phân protein trong viên nang nhung hươu thành acid amin. - Định tính các acid amin bằng phản ứng hóa học, sắc ký lớp mỏng (SKLM) và SKLHNC - Xây dựng quy trình định lượng một số acid amin trong viên nang nhung hươu ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu Viên nang Nhung hươu chứa 500 mg bột khô nhung hươu của Viện YDHDT. + Chuẩn đối chiếu: Tên Hàm lượng Lô Nguồn - L-Alanin 100,59 % 0100071 Viện KN thuốc TW Glycin 99,10 % 0100068 Viện KN thuốc TW Histidin.HCl 100,5 % 0100065 Viện KN thuốc TW L-Arginin 99,83 % 0100077 Viện KN thuốc TW L-Lysin.HCl 99,80 % 0100078 Viện KN thuốc TW L-Serin 99,09 % 0100091 Viện KN thuốc TW L-Valin 99,90 % 0100069 Viện KN thuốc TW L-Isoleucin 99,880 % 0100073 Viện KN thuốc TW L-Leucin 99,14% 0100080 Viện KN thuốc TW Phenylalanin 99,50 % 0100070 Viện KN thuốc TW Prolin 99,30 % 0100083 Viện KN thuốc TW Threonin 100,26 % 0100074 Viện KN thuốc TW Chuẩn nội: 3-Nitro-L-tyrosin (Sigma Aldrich, Pcode: 101005822, CAS: 621-44-3) Thuốc thử: 4-(Dimethylamino)azobenzen-4’- sulfonyl clorid (DABS-Cl, Fluka, Pcode: 100999094, CAS: 56512-49-3). Phương pháp nghiên cứu - Khảo sát và chọn thời gian thủy phân protein thành acid amin (AA) bằng SKLM và SKLHNC: chiết kiệt protein trong 10 g bột thuốc bằng Soxhlet với EtOH 75%, thu 10 ml dịch chiết; thủy phân bằng 0,5% phenol / HCl 6 M ở 110 oC trong 6 h, 12 h, 18 h, 24 h và 30 h, cô dến cắn. - Định tính AA bằng phản ứng hóa học (pưhh), SKLM và SKLHNC. - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các AA bằng SKLHNC. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Khảo sát và chọn thời gian thủy phân protein bằng sắc ký lớp mỏng Mẫu thành phẩm thủy phân trong 1. 6 h 2. 12 h 3. 18 h 4. 24 h 5. 30 h 6. Hỗn hợp các acid amin (Arg, Lys, Gly, Ala, His, Val. Phe) 7. Mẫu nguyên liệu thủy phân trong 24 h Hình 1: Sắc ký đồ các mẫu thủy phân protein trong các thời gian khác nhau Các vết acid amin ở các mẫu thùy phân trong 18 h, 24 h và 30 h có màu sắc gần như tương đương, do đó phải dùng HPLC để xác định thời gian thủy phân thích hợp dựa vào tỉ lệ diện tích pic của các acid amin và nội chuẩn. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 205 Khảo sát và chọn thời gian thủy phân protein bằng HPLC Hình 2: Tỷ lệ diện tích đỉnh của các acid amin và nội chuẩn (Saa/Sis) ở các thời gian thủy phân 18, 24, 30 giờ. Để định lượng đồng thời 6 acid amin Serin, Glycin, Alanin, Valin, Leucin và Phenylalanin thì thời gian thủy phân protein tốt nhất là 24 h. + Định tính bằng phản ứng hóa học: dịch thủy phân protein cho phản ứng dương tính với thuốc thử Ninhydrin (có acid α-amin), thuốc thử Millon (phát hiện tyrosin), Saccaguichi (nhận biết Arginin), Xanthoproteic (phát hiện acid amin vòng). + Định tính acid amin bằng SKLM 2 chiều: Chiều 1: Isopropanol – amoniac đđ (7:3) Chiều 2: n-butanol – acid acetic băng – nước (3:1:1) Hình 2: SK đồ 2 chiều 7 AA chuẩn (Arg, Lys, Gly, Ala, His, Val và Phe) và mẫu viên Trên SK đồ xác định được một số acid amin trong viên nhung hươu hầu như có đủ các acid amin trong hỗn hợp chuẩn (Arginin, Lysin, Glycin, Alanin, Histidin, Valin và Phenylalanin), ngoài ra có 5 acid amin khác chưa xác định (đánh dấu ). Do đó có thể dùng SKLM 2 chiều xem như SK dấu vân tay để định tính các acid amin trong nhung hươu. + Định tính acid amin bằng SKLHNC: Hỗn hợp Thử Arg Lys Gly Ala His Val Phe Arg Lys Gly Ala His Val Phe Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 206 Hình 3: Sắc ký đồ định tính các acid amin có trong chế phẩm Hệ thống SKLHNC Alliance Waters 2695; đầu dò PDA 2996; Cột sắc ký Xterra, RP 18 (4,6 x 250 mm; 5 μm); Nhiệt độ cột: 40 oC; Thể tích tiêm: 20 μl; Tốc độ dòng: 1 ml/phút; Bước sóng phát hiện: 460 nm; Pha động: Acetonitril – dung dịch đệm (Natri acetat 25 mM pH 6,5 chứa 4% DMF), chương trình gradient dung môi theo bảng 1. Bảng 1: Chương trình gradient dung môi Thời gian (phút) Acetonitril (%) dung dịch đệm (%) 1 15 85 20 40 60 32 70 30 34 70 30 36 15 85 44 15 85 Sắc ký đồ cho thấy đỉnh của chuẩn nội (3- Nitro-L-tyrosin) tách rõ rệt ở 32,64 phút và được rửa giải tại vùng có ít đỉnh của các acid amin trong viên nang nhung hươu. Diện tích và chiều cao đỉnh của chuẩn nội tương đương với diện tích và chiều cao các đỉnh khác trong sắc ký đồ. Xây dựng quy trình định lượng đồng thời các acid amin bằng SKLHNC - Điều kiện sắc ký như trên Dung dịch nội chuẩn: cân 28,3 mg Nitro tyrosin vào bình định mức 20 ml, hòa tan bằng HCl 0,01 N và điền đến vạch với cùng dung dịch. Hút chính xác 1 ml dung dịch trên cho vào bình định mức 10 ml, pha loãng bằng nước cất 2 lần và điền đến vạch. Dung dịch mẫu chuẩn đối chiếu: Chuẩn bị một hỗn hợp chuẩn 6 acid amin trong dung dịch HCl 0,001 N có nồng độ tương tự mẫu cần phân tích: Serin 34,4 ig/ml, Glycin 172,9 ig/ml, Alanin 142,9 ig/ml, Valin 37,5 ig/ml, Leucin 48,7 ig/ml, Phenylalanin 90,6 ig/ml. - Dung dịch mẫu thử: sau khi chiết protein từ mẫu thử bột nhung hươu, thủy phân protein thành acid amin trong 24 giờ. Hòa cắn thủy phân 24 h với lượng vừa đủ dung dịch HCl 0,001 N, cho vào bình định mức 10 ml, tráng sạch cốc và điền đến vạch với cùng dung dịch. Lọc bỏ 2ml dịch lọc đầu (dung dịch thử gốc). Hút chính xác 5 ml dịch lọc cho vào bình định mức 10 ml, thêm nước cất đến vạch (dung dịch phản ứng). Thực hiện phản ứng tạo dẫn chất trước khi qua cột sắc ký: hút chính xác 125 μl dung dịch mẫu chuẩn (thử), thêm chính xác 125 μl dung dịch nội chuẩn, thêm 250 μl dung dịch đệm Natri bicarbonat 100 mM (pH 8,3), L ys in Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dược Học 207 thêm 1 ml thuốc thử DABS-Cl 4 mM. Lắc rung nhanh, ủ ở nhiệt độ từ 70 – 72 oC. Để nguội trong 5 phút. Thêm 3,5 ml dung dịch Na2HPO4 50 mM (pH 7,0): EtOH (1:1), lắc rung 30 giây, lọc qua màng lọc 0,45 mm (Dung dịch tiêm vào hệ thống sắc ký). Đánh giá quy trình phân tích Khảo sát tính tương tích hệ thống Mỗi acid amin đều có RSD% của các thông số đều đạt qui định: α > 1; RS ≥ 1,5; 0,8 ≤ AS ≤ 1,5; N khá lớn: > 75.000. Vậy quy trình lượng đồng thời Serin, Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Phenylalanin đạt tính tương thích hệ thống Khảo sát tính đặc hiệu Kết quả khảo sát cho thấy Mẫu trắng và nội chuẩn không có đỉnh trùng với đỉnh của hoạt chất. Khi thêm một lượng acid amin chuẩn vào mẫu thử, diện tích đỉnh của acid amin tương ứng tăng lên so với trước khi thêm chuẩn. Phổ UV-Vis của mẫu thử giống phổ UV-Vis của mẫu chuẩn. Kiểm tra độ tinh khiết của các pic trong mẫu thừ và mẫu chuẩn đều đạt (Purity Angle (PA) < Purity Threshold (TH)). Khảo sát độ lặp lại Kết quả 6 lần đo cho kết quả RSD đều < 2,0%. Khảo sát tính tuyến tính Bảng 2: Phương trình hồi quy tuyến tính và hệ số tương quan giữa nồng độ và tỷ lệ diện tích đỉnh. Acid amin Phương trình hồi quy Hệ số tương quan Khoảng nồng độ (mg/ml) Serin ŷ = 8,5006 x R² = 0,9998 0,0185 – 0,1298 Glycin ŷ = 11,6472 x R2 = 0,9991 0,0582 – 0,4658 Alanin ŷ = 7,1457 x R² = 0,9996 0,0924 – 0,7396 Valin ŷ = 7,6209 x R² = 0,9993 0,0209 – 0,1464 Leucin ŷ = 7,2633 x R² = 0,9999 0,0264 – 0,1849 Phenylalanin ŷ = 1,3892 x R² = 0,9992 0,0519 – 0,4149 Khảo sát độ đúng Kết quả cho thấy tỷ lệ phục hồi thực nghiệm hàm lượng của 6 acid amin đều nằm trong khoảng 98 – 102%. Kết luận: quy trình định lượng đồng thời 6 acid amin Serin Glycin, Alanin, Valin, Leucin và Phenylalanin trong dịch thủy phân viên nang nhung hươu bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao đạt yêu cầu về tính tương thích hệ thống, tính đặc hiệu, độ lập lại, tính tuyến tính và độ đúng của một quy trình kiểm nghiệm. Kết quả định lượng các acid amin trong viên nang nhung hươu Bảng 3: Kết quả định lượng 6 acid amin trong viên nang nhung hươu trong 3 lô STT Serin (mg/viên) Glycin (mg/viên) Alanin (mg/viên) Valin (mg/viên) Leucin (mg/viên) Phenylalanin (mg/viên) Lô 010111 RSD (%) 0,88 0,88 1,30 1,39 1,42 1,53 µ 0,38 ± 0,0035 1,92 ± 0,0177 1,58 ± 0,0216 0,42 ± 0,0060 0,54 ± 0,0080 1,00 ± 0,0161 lô 020411 RSD (%) 1,35 1,27 1,69 1,52 1,25 1,43 µ 0,34 ± 0,0048 1,79 ± 0,0238 1,48 ± 0,0262 0,39 ± 0,0062 0,49 ± 0,0064 0,91 ± 0,0137 lô 030711 RSD (%) 1,76 0,91 1,03 1,71 1,25 1,00 µ 0,38 ± 0,0070 1,90 ± 0,0181 1,56 ± 0,0169 0,39 ± 0,0069 0,50 ± 0,0066 1,03 ± 0,0107 KẾT LUẬN Qua thực nghiệm, đề tài đạt được các kết quả nghiên cứu như sau: + Chiết và thủy phân protein ở pha lỏng bằng HCl 6 M chứa 0,5% phenol trong ống thủy phân. + Định tính acid amin bằng sắc ký lớp mỏng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 18 * Phụ bản của Số 2 * 2014 Chuyên Đề Dược Học 208 1 chiều và 2 chiều. + Tạo dẫn chất trước cột của các acid amin với thuốc thử DABS-Cl. + Sử dụng chương trình gradient dung môi trong phương pháp SKLHNC với detector PDA để phân tích hỗn hợp acid amin. + Xây dựng và đánh giá quy trình xác định đồng thời hỗn hợp 6 acid amin Serin, Glycin, Alanin, Valin, Leucin và Phenylalanin trong dịch thủy phân viên nang Nhung hươu của Viện Y Dược Học Dân tộc TP.HCM với kỹ thuật tạo dẫn chất tiền cột với thuốc thử DABS-Cl. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bộ Y Tế (2009), "Chuyên luận Lộc Nhung" Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học. 2. Bộ Y Tế (2009), "Phụ lục 10,11 Phương pháp phân tích acid amin", Dược Điển Việt Nam IV, Nhà xuất bản Y học. 3. Trần Thị Bích Vân, Trần Việt Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Chinh, Bùi Đình Sơn (2008), "Nghiên cứu định tính, định lượng 8 acid amin thiết yếu trong chế phẩm thuốc bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao - tạo dẫn xuất ngoài cột", Kiểm nghiệm thuốc, 6 (19): 13 – 16. 4. Viện Dược liệu (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 1, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, tr. 1133 – 1136 Ngày nhận bài báo: 14.12.2012 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 20.3.2013 Ngày bài báo được đăng: 10.03.2014