Xây dựng quy trình định lượng một số chất bảo quản nhóm paraben trong chế phẩm kem bôi da bằng HPLC-PDA

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 436 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ CHẤT BẢO QUẢN NHÓM PARABEN TRONG CHẾ PHẨM KEM BÔI DA BẰNG HPLC-PDA Huỳnh Xuân Vinh*, Nguyễn Đức Tuấn* TÓM TẮT Mở đầu – Mục tiêu: Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, nhu cầu làm đẹp của con người ngày càng tăng, kéo theo đó là sự ra đời của nhiều loại mỹ phẩm. Trong một thị trường mang tính cạnh tranh cao, có không ít nhà sản xuất sẳn sàng vì lợi nhuận đã đưa ra thị trường những sản phẩm kém chất lượng bằng việc đưa vào những chất hóa học bị cấm hoặc vượt quá giới hạn cho phép, trong đó có chất bảo quản nhóm paraben. Vì vậy, nghiên cứu này được thực hiện với mục tiêu xây dựng một quy trình nhanh chóng, đơn giản, ít tiêu tốn dung môi khi tiến hành định lượng đồng thời một số paraben trong chế phẩm kem bôi da đang có trên thị trường. Đối tượng – Phương pháp nghiên cứu: Đối tượng nghiên cứu: Methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben và isobutylparaben. Phương pháp nghiên cứu: Khảo sát một số điều kiện sắc ký ảnh hưởng đến quá trình phân tích các paraben như hệ dung môi, tỷ lệ pha động, pH, nhiệt độ cột, v.v. Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện, hiệu suất chiết, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính xác và độ đúng. Quy trình sau khi được thẩm định sẽ được ứng dụng để kiểm tra các paraben trong một số chế phẩm kem bôi da có mặt trên thị trường. Kết quả: Đã xác định được điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben và isobutylparaben như sau: cột sắc ký Phenomenex Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 3 µm), đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 254 nm, pha động acetonitril và nước acid acetic pH 3 (35:65), thể tích tiêm mẫu 10 µl, tốc độ dòng 1 ml/phút. Quy trình phân tích đã được thẩm định đạt tính phù hợp hệ thống, có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, đạt yêu cầu về độ đúng (tỷ lệ phục hồi trong khoảng 94% – 109%) và độ lặp lại (RSD < 2%), hiệu suất chiết cao và ổn định, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp. Kết quả kiểm tra các paraben trong một số chế phẩm kem bôi da đang lưu hành tại Việt Nam cho thấy hàm lượng các paraben nằm ở mức giới hạn cho phép. Kết luận: Quy trình định lượng đồng thời methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, isobutylparaben bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA đã được xây dựng và thẩm định, sử dụng chương trình rửa giải đẳng dòng và pha động không có dung dịch đệm. Quy trình đã được ứng dụng để kiểm tra các paraben trong một số chế phẩm kem bôi da đang có trên thị trường. Từ khóa: Methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, isobutylparaben, chất bảo quản nhóm paraben, kem bôi da, HPLC-PDA ABSTRACT SIMULTANEOUS DETERMINATION OF SEVERAL PARABEN PRESERVATIVES IN SKIN CREAMS BY HPLC – PDA Huynh Xuan Vinh, Nguyen Duc Tuan * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Supplement Vol. 22 - No 2- 2018: 436 - 444 Background – Objectives: Along with development of economy, the demand for aestheticizing people is * Khoa Dược, Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Tác giả liên lạc: PGS. TS. Nguyễn Đức Tuấn ĐT: 0913 799 068 Email: ductuan@ump.edu.vn Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 437 increasing, that leads to launch variety of cosmetics. In a highly competitive market and in order to achieve high profits, many manufacturers have launched poor quality cosmetics by using banned or over accepted limit chemicals, such as paraben preservatives. Therefore, this study was carried out with the aim of development of a fast, simple and less-solvent-consumption HPLC method for simultaneous quantitative determination of several paraben preservatives in skin creams. Method: The subject of this study was methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, butyl paraben and isobutyl paraben. Method: Several chromatographic conditions such as mobile phase, pH, column temperature, etc. that affects selectivity and separation efficiency, were investigated. Once the appropriate chromatographic conditions were achieved, the analytical procedure was validated, including system suitability, selectivity, limit of quantitation, limit of detection, extraction recovery, linearity and range, precision and accuracy. Then the validated procedure was applied for simultaneous determination of parabens in some available skin creams. Results: The appropriate chromatographic conditions for complete separation of methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, butyl paraben, isobutyl paraben were obtained on Gemini-NX C18 column (150 x 4.6 mm; 3 µm), PDA detector with detection wavelength at 254 nm, mixture of acetonitrile and acetic acid pH 3.0 (35:65) as mobile phase, injection volume of 10 µL, flow rate of 1.0 ml/min. Validation results showed that the method was suitable for the HPLC system, selective, linear, accurate (the recoveries in the range of 94.0%-109.0% of the expected values), precise (RSD ≤ 2%), high and stable extraction recovery, and high sensitivity. All the calculations concerning the quantitative analysis showed that several available skin creams in Vietnam market contained an amount of paraben preservatives that was below accepted limits. Conclusion: The RP-HPLC method for simultaneous determination of methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, butyl paraben, and isobutyl paraben was successfully developed and validated, using isocratic mode and mobile phase without buffer. The proposed method was applied for quantitation of paraben preservatives in some skin creams available in the market. Keyword: methyl paraben, ethyl paraben, propyl paraben, butyl paraben, isobutyl paraben, paraben preservatives, skin cream, HPLC-PDA ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự phát triển của nền kinh tế, nhu cầu l|m đẹp của con người ng|y c|ng tăng, kéo theo đó l| sự ra đời của nhiều loại mỹ phẩm. Trong một thị trường mang tính cạnh tranh cao, có không ít nhà sản xuất sẳn sàng vì lợi nhuận đã đưa ra thị trường những sản phẩm kém chất lượng bằng việc đưa v|o những chất hóa học bị cấm hoặc vượt quá giới hạn cho phép, trong đó có chất bảo quản nhóm paraben. Ngày 13 tháng 4 năm 2015, Cục Quản lý Dược ban hành công văn số 6577/QLD-MP(1) về việc cập nhật danh s{ch c{c paraben được phép sử dụng trong mỹ phẩm với h|m lượng giới hạn gồm methylparaben (MP), ethylparaben (EP), propylparaben (PP), butylparaben (BP) và 5 paraben bị cấm dùng trong mỹ phẩm, bao gồm isopropylparaben (isoPP), isobutylparaben (isoBP), pentylparaben (PenP), phenylparaben (PheP) v| benzylparaben (BenP). Khi công văn được ban hành, hàng loạt các mẫu mỹ phẩm có chứa 5 chất paraben bị cấm đã được thu hồi, song vẫn còn tồn đọng những mẫu không đạt chất lượng còn lưu h|nh trên thị trường. Bên cạnh đó, do nồng độ của chất bảo quản paraben khá nhỏ, theo quy định của ASEAN(3), giới hạn cho phép của methylparaben và ethylparaben là 0,4% mỗi chất nếu dùng riêng lẻ và 0,8% nếu dùng hỗn hợp; với propylparaben và butylparaben là 0,14% cả dạng đơn lẻ lẫn hỗn hợp; và tổng h|m lượng các paraben không được quá 0,8% trong chế phẩm. Một số nhà sản xuất khi không sử dụng được các paraben cấm đã tăng h|m lượng những paraben cho phép sử dụng vượt quá giới hạn cho phép. Một khảo sát Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 438 năm 2016 cuả Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm TPHCM đã ph{t hiện có 2/10 mẫu kem khảo s{t không đạt giới hạn hàm lượng paraben. Việc định lượng đồng thời 4 paraben MP, EP, PP v| BP đã được hướng dẫn cụ thể trong tài liệu ACM INO 04 của ASEAN(4), sử dụng kỹ thuật HPLC. Tuy nhiên, quy trình này có một số hạn chế như tiêu hao lượng dung môi và hóa chất lớn khi sử dụng pha động gồm 4 loại dung môi, thời gian ph}n tích d|i, chưa khảo sát khả năng t{ch đối với c{c paraben l| đồng phân vị trí như propylparaben v| isopropylparaben, butylparaben và isobutylparaben, < v| c{c chất được phép và không được phép sử dụng trong nhóm paraben. Với những lý do trên, nghiên cứu n|y được thực hiện để góp phần khắc phục các hạn chế của quy trình ph}n tích đồng thời các chất bảo quản nhóm paraben trong các mẫu kem bôi da bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao như cải thiện khả năng t{ch, r t ngắn thời gian phân tích và ít tiêu tốn dung môi, hóa chất. ĐỐI TƢỢNG - PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tƣợng nghiên cứu Methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben và isobutylparaben trong mẫu kem bôi da giả lập. Nguyên vật liệu Chất đối chiếu Bảng 1: Danh mục chất đối chiếu dùng trong nghiên cứu MP EP PP BP isoBP Nhà cung cấp Viện Kiểm Nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh Số lô QT128 060815 NLQT004 011214 QT130 060816 NLQT002 020716 NLQT003 011214 Độ tinh khiết theo nguyên trạng 100,08% 96,62% 100,01% 99,2% 99,16% Trang thiết bị Hệ thống HPLC Alliance 2695XE ghép nối với đầu dò PDA 2996, hệ thống HPLC Alliance e2695 ghép nối với đầu dò PDA 2998, cột sắc ký Phenomenex C18 (150 x 4,6 mm; 3 µm), cân phân tích Satorius CP 225D (max = 220 g, d = 0,01 mg), bể siêu âm T840 DH – Elma, m{y đo pH S220 Metler Toledo, bể cách thủy Memmert. Hóa chất và dung môi Acetonitril v| methanol đạt tiêu chuẩn dùng trong sắc ký lỏng (Merck). Acid acetic băng v| ethanol đạt tiêu chuẩn phân tích (Merck). Mẫu kem bôi da không paraben Mẫu kem bôi da không paraben được sử dụng để tạo mẫu giả lập là INNISFREE OLIVE REAL MOISTURE HAND CREAM với thành phần nước, glycerin, butylen glycol, ceatearyl alcol,< được sản xuất bởi công ty Innisfree Hàn Quốc, số lô T13805, hạn dùng 28/12/2019. Chuẩn bị mẫu Từ mức giới hạn cho phép của các paraben trong các chế phẩm kem bôi da, các dung dịch chuẩn và mẫu giả lập được chuẩn bị sao cho nồng độ sau cùng của c{c paraben tương ứng với mức giới hạn cho phép, cụ thể như sau: MP và EP 40 ppm, PP và BP 14 ppm. Với isoBP là chất không được phép sử dụng trong mỹ phẩm sẽ được chuẩn bị ở nồng độ 9 ppm. Sau khi khảo sát LOD và LOQ của 5 paraben, isoBP sẽ được chuẩn bị ở nồng độ tương đương với LOQ. Khi thẩm định quy trình phân tích, ngoại trừ chỉ tiêu tính đặc hiệu, các chỉ tiêu kh{c đều được tiến hành ở mức nồng độ của isoBP bằng với LOQ. Dung dịch đối chiếu gốc của từng paraben Cân chính xác khoảng 10 mg MP (với EP là 10 mg và PP, BP, BP là 5 mg), cho vào bình định mức 25 ml, thêm khoảng 15 ml dung môi pha mẫu gồm ethanol v| nước (9:1), lắc cho tan, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, thu được 5 dung dịch đối chiếu gốc có Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 439 nồng độ MP và EP là 400 ppm; PP, BP và isoBP là 200 ppm. Dung dịch đối chiếu gốc hỗn hợp paraben Cân chính xác khoảng 32 mg MP và EP, 11,2 mg PP và BP, cho v|o bình định mức 50 ml (bình A). Cân chính xác khoảng 5 mg isoBP, cho vào bình định mức 200 ml, thêm khoảng 40 ml dung môi pha mẫu, lắc cho tan, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch isoBP có nồng độ 25 ppm (dung dịch B). Hút chính xác 8,65 ml dung dịch B, cho vào bình A, thêm khoảng 25 ml dung môi pha mẫu, lắc cho tan, thêm tiếp dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch đối chiếu gốc hỗn hợp paraben có nồng độ MP, EP là 640 ppm, PP và BP là 224 ppm, isoBP là 4,32 ppm. Dung dịch đối chiếu 1 Hút chính xác 1 ml dung dịch đối chiếu gốc MP, 1 ml dung dịch đối chiếu gốc EP; 0,7 ml dung dịch đối chiếu gốc PP; 0,7 ml dung dịch đối chiếu gốc BP và 0,45 ml dung dịch đối chiếu gốc isoBP, cho v|o bình định mức 10 ml, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch có nồng độ MP và EP khoảng 40 ppm, PP và BP khoảng 14 ppm và isoBP khoảng 9 ppm. Dung dịch đối chiếu 2 Hút chính xác 625 µl dung dịch đối chiếu gốc hỗn hợp paraben, cho v|o bình định mức 10 ml, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, thu được dung dịch có nồng độ MP và EP khoảng 40 ppm, PP và BP khoảng 14 ppm, isoBP khoảng 0,27 ppm. Dung dịch mẫu kem không paraben Cân chính xác khoảng 1000 mg kem không paraben, cho v|o bình định mức 100 ml, thêm 5 ml dung dịch H2SO4 2 M, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, siêu }m 10 ph t, đun cách thủy 60oC trong khoảng 5 ph t, để yên trong tủ lạnh 1 giờ sau đó để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µm. Dung dịch mẫu giả lập Cân chính xác khoảng 1000 mg mẫu kem không paraben, cho v|o bình định mức 100 ml. Hút chính xác 10 ml dung dịch đối chiếu gốc MP, 10 ml dung dịch đối chiếu gốc EP; 7 ml dung dịch đối chiếu gốc PP; 7 ml dung dịch đối chiếu gốc BP; 4,5 ml dung dịch đối chiếu gốc isoBP; thêm 5 ml dung dịch H2SO4 2 M, thêm dung môi pha mẫu đến vạch, lắc đều, siêu }m 10 ph t, đun c{ch thủy 60oC trong khoảng 5 ph t, để yên trong tủ lạnh 1 giờ sau đó để ổn định ở nhiệt độ phòng khoảng 30 phút, lọc qua màng lọc PTFE 0,45 µm. Mẫu trắng Pha động và dung môi pha mẫu. Phƣơng pháp nghiên cứu Dựa v|o đặc tính của các paraben là những chất ít phân cực, đồng thời tham khảo một số quy trình định lượng đồng thời paraben bằng kỹ thuật HPLC(3-5), kỹ thuật sắc ký pha đảo với hệ dung môi phân cực đã được áp dụng với điều kiện sắc ký ban đầu như sau: cột sắc ký Phenomenex Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 3 m), đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 254 nm, thể tích tiêm mẫu 10 µl. Tiến hành khảo sát một số điều kiện sắc ký ảnh hưởng đến qu{ trình ph}n tích c{c paraben như hệ dung môi, tỷ lệ pha động, pH, nhiệt độ cột, v.v. Sau khi tìm được điều kiện sắc ký thích hợp, tiến hành thẩm định quy trình phân tích bao gồm khảo sát tính phù hợp hệ thống, tính đặc hiệu, giới hạn định lượng, giới hạn phát hiện, hiệu suất chiết, tính tuyến tính và miền giá trị, độ chính x{c v| độ đ ng. Quy trình sau khi được thẩm định sẽ được ứng dụng để kiểm tra các paraben trong một số chế phẩm kem bôi da có trên thị trường. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 440 KẾT QUẢ Khảo sát điều kiện sắc ký Bảng 2: Kết quả khảo sát các hệ dung môi pha động Pha động Tỷ lệ dung môi pha động Tốc độ dòng (ml/phút) Thời gian sắc ký (phút) Độ phân giải giữa BP và IsoBP Hệ số bất đối của các pic Độ tinh khiết pic MeOH – Nƣớc – ACN – THF 10:60:25:5 1,0 28 1,91 1,1-1,2 h ng đạt 15:60:20:5 1,0 23,5 1,94 1,1-1,2 Đạt ACN – Nước acid acetic pH 3 35:65 0,8 24 1,73 1,1-1,2 Đạt Hình 1: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha động MeOH - nước - ACN - THF (10:60:25:5) Hình 2: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha động MeOH - nước - ACN - THF (15:60:20:5) Hình 3: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha động ACN - nước acid acetic pH 3 (35:65) Nhận xét: MP, EP v| PP đều tách hoàn toàn trong các hệ dung môi trên. Tuy nhiên, hệ dung môi ACN – nước acid acetic pH 3 được lựa chọn để tiếp tục khảo sát vì chỉ gồm 2 thành phần, thời gian phân tích ngắn, các pic đều tinh khiết và có hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8-1,5, đồng thời 2 pic BP và isoBP tách hoàn toàn (Rs > 1,5). Với hệ ACN – nước acid acetic pH 3 được lựa chọn, tiếp tục khảo sát tỷ lệ dung môi và pH pha động đồng thời điều chỉnh tốc độ dòng và nhiệt độ cột để lựa chọn được điều kiện sắc ký thích hợp. Bảng 3 tóm tắt kết quả khảo sát với hệ pha động ACN - nước acid acetic ở các điều kiện khác nhau. Hình 4 đến hình 8 minh họa sắc ký đồ dung dịch đối chiếu 1 ở các điều kiện khảo sát. Bảng 3: Kết quả khảo sát với hệ ACN – nước acid acetic pH 3 và pH 3,75 pH Tỷ lệ Tốc độ dòng (ml/phút) Nhiệt độ cột ( o C) Thời gian sắc ký (phút) Độ phân giải giữa BP và IsoBP Hệ số bất đối của các pic Độ tinh khiết pic 3,00 35:65 1 - 18,0 1,69 1,1-1,3 Đạt 3,00 35:65 1 40 16,8 1,59 1,1-1,3 Đạt 3,00 40:60 0,8 - 14,7 1,43 1,0-1,1 Đạt 3,75 40:60 1 - 12,4 1,54 1,0-1,2 Đạt 3,00 45:55 1 - 9,8 1,17 - h ng đạt Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 441 Hình 4: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha động ACN - nước acid acetic pH 3 (35:65),1 ml/phút Hình 5: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha động ACN - nước acid acetic pH 3 (35:65), 1 ml/phút, nhiệt độ cột 40oC Hình 6: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha động ACN - nước acid acetic pH 3 (40:60); 0,8 ml/phút Hình 7: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha động ACN - nước acid acetic pH 3,75 (40:60), 1ml/phút Hình 8: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 tại điều kiện pha động ACN - nước acid acetic pH 3 (45:55), 1 ml/phút Nhận xét: MP, EP v| PP đều tách hoàn toàn trong c{c điều kiện sắc ký trên. Tuy nhiên, hệ pha động ACN – nước acid acetic pH 3 (35:65) và tốc độ dòng 1 ml/ph t được lựa chọn vì độ phân giải giữa BP và isoBP cao nhất, thời gian sắc ký dưới 20 phút, các pic paraben đều đạt độ tinh khiết và có hệ số bất đối nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Như vậy điều kiện sắc ký thích hợp để định lượng đồng thời 5 paraben bằng phương ph{p HPLC với đầu dò PDA là: cột sắc ký Phenomenex Gemini-NX C18 (150 x 4,6 mm; 3 m), đầu dò PDA, bước sóng phát hiện 254 nm, pha động acetonitril – nước acid acetic pH 3 (35:65), tốc độ dòng 1,0 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 10 µl. Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 442 Thẩm định quy trình Khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng 4: Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống trên mẫu giả lập (n=6) tR (phút) S (µVxgiây) As Rs MP TB 3,837 2495607 1,35 3,06 RSD 0,08% 0,16% 0,23% 0,62% EP TB 5,790 2426904 1,24 11,01 RSD 0,10% 0,17% 0,34% 0,53% PP TB 9,772 820287 1,27 15,30 RSD 0,07% 0,18% 0,29% 0,71% isoBP TB 16,703 12022 1,14 18,24 RSD 0,08% 1.05% 0,88% 0,56% BP TB 17,595 734935 1,1 1,78 RSD 0,07% 0,28% 0,30% 1,12% Nhận xét: RSD của các thông số sắc ký của các chất phân tích trong mẫu giả lập đều nhỏ hơn 2%, độ phân giải đều lớn hơn 1,5 v| hệ số bất đối đều nằm trong khoảng 0,8 – 1,5. Vậy quy trình định lượng đồng thời 5 paraben có tính phù hợp hệ thống. Tính đặc hiệu Kết quả khảo s{t tính đặc hiệu cho thấy: sắc ký đồ mẫu trắng và mẫu kem không paraben không xuất hiện pic trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của các paraben trong mẫu đối chiếu. Sắc ký đồ mẫu giả lập xuất hiện pic có thời gian lưu tương đương thời gian lưu của mỗi paraben trong sắc ký đồ mẫu đối chiếu. Trên sắc ký đồ mẫu giả lập các pic paraben tách hoàn toàn. Phổ UV-Vis tại thời gian lưu của các pic paraben trong sắc ký đồ mẫu giả lập giống với phổ UV-Vis tại thời gian lưu của pic tương ứng trong sắc ký đồ mẫu đối chiếu. Hình 9: Sắc ký đồ pha động Hình 10: Sắc ký đồ dung môi pha mẫu Hình 11: Sắc ký đồ mẫu kem không paraben Hình 12: Sắc ký đồ mẫu đối chiếu 1 Hình 13: Sắc ký đồ mẫu giả lập Khoảng tuyến tính, giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), hiệu suất chiết, độ chính xác và độ đúng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Nghiên cứu Y học Chuyên Đề Dƣợc 443 Bảng 5: Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính, LOD, LOQ, hiệu suất chiết, độ chính xác và độ đúng MP EP PP isoBP BP Phƣơng trình hồi qui ŷ = 59646x ŷ = 56617x ŷ = 50186x ŷ = 42468x ŷ = 45870x Khoảng tuyến tính (ppm); R 24 - 64; 0,9995 24 - 64; 0,9992 8,4 - 22,4; 0,9994 0,16 - 0,43; 0,9995 8,4 - 22,4; 0,9995 LOD (ppm) 0,017 0,044 0,047 0,090 0,140 LOQ (ppm) 0,050 0,130 0,140 0,270 0,420 Hiệu suất chiết * (RSD) (n=9) 92,45%-100,00% (0,16%-0,92%) 94,26%-100,83% (0,15%-0,35%) 93,67%-100,83% (0,18%-0,43%) 91,21%-96,18% (1,05%-1,65%) 97,77%-105,40% (0,28%-0,40%) Độ đúng và độ chính xác * (RSD) (n=9) 101,02% – 108,47% (0,72% - 1,19%) 97,94%-105,58% (0,26%-1,10%) 99,28%-107,90% (0,64%-1,31% 95,76%-105,55% (1,29%-1,55%) 94,20%-101,18% (0,26%-1,25%) * Hiệu suất chiết, độ chính xác và độ đúng được thực hiện tại 3 mức nồng độ 80%, 100% và 120% giới hạn cho phép của MP, RP, PP, BP và đối với isoBP là 3 mức nồng độ của LOQ. Các pic paraben trong sắc ký đồ mẫu đối chiếu và và mẫu giả lập đều tinh khiết. Vậy quy trình ph}n tích có tính đặc hiệu. Hình 9 đến hình 13 minh họa kết quả khảo s{t tính đặc hiệu. Bảng 5 trình bày kết quả xử lý thống kê cho thấy giá trị F của 5 paraben đều lớn hơn F0,05 nên phương trình hồi quy tương thích. Giá trị t của hệ số B của 5 paraben đều lớn hơn t0,05 nên giá trị B có ý nghĩa. Gi{ trị t của hệ số Bo của 5 paraben nhỏ hơn t0,05 nên hệ số Bo không có ý nghĩa. Hệ số tương quan r có gi{ trị lớn hơn 0,999. Hiệu suất chiết của các paraben trong mẫu giả lập khá cao (> 90%) và ổn định (RSD < 2%). Phương ph{p ph}n tích đạt yêu cầu về độ đ ng (tỷ lệ hồi phục trong khoảng 85% - 109%) v| độ chính xác (RSD < 5,3%)(6). Như vậy quy trình định lượng đồng thời 5 paraben bằng phương ph{p sắc ký lỏng hiệu năng cao với đầu dò PDA có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp, hiệu suất chiết cao và ổn định, đạt độ chính x{c v| độ đ ng nên có thể được ứng dụng để định lượng paraben trong chế phẩm kem bôi da. Ứng dụng quy trình định lƣợng paraben trong một số chế phẩm kem bôi da có trên thị trƣờng ảng Kết quả định lượng các paraben trong chế phẩm kem bôi da (n=4) Mẫu kem Xuất xứ Số lô Hạn dùng Chất bảo quản công bố trên nhãn Hàm lượng paraben KN1 Việt Nam 5 20/5/2018 Không công bố MP: < LOD KN2 Việt Nam 220816 RJY 09/09/2019 Methylparaben 0,20% Propylparaben 0,10% KN3 Việt Nam 001 04/01/2018 Methylparaben MP: 0,15%; PP: 0,08% KN4 Thái Lan LOT30 1/11/2019 Propylparaben 0,13% KN5 Thái Lan 012016 5/11/2019 Methylparaben 0,15% Propylparaben 0,08% KN6 Việt Nam 67056103 06/06/2018 Methylparaben 0,14% Propylparaben 0,05% Nhận xét: Kết quả khảo sát cho thấy các mẫu kem đều sử dụng đ ng c{c paraben như công bố trên nhãn ngoại trừ sản phẩm kem bôi da KN3 (sử dụng MP và PP làm chất bảo quản nhưng chỉ công bố trên nhãn chất bảo quản MP). Tất cả các sản phẩm đều có h|m lượng paraben nhỏ hơn mức giới hạn cho phép. Không có mẫu kem nào chứa paraben cấm isobutylparaben. BÀN LUẬN Có rất nhiều công trình nghiên cứu định lượng đồng thời các paraben trong mỹ phẩm, trong đó có sự đa dạng về thành phần pha động từ MeOH, ACN đến THF, đệm phosphat, v.v với đầu dò thay đổi từ PDA, MS đến đầu dò quang hóa, v.v Thời gian tiến hành sắc ký cũng thay đổi tùy theo số lượng các paraben Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Phụ Bản Tập 22 * Số 1 * 2018 Chuyên Đề Dƣợc 444 cần định lượng cũng như thành phần pha động. Nhìn chung, nghiên cứu này đã tìm ra điều kiện sắc ký thích hợp để tách hỗn hợp các paraben, trong đó có những paraben là đồng phân vị trí (như isobutylparaben và butylparaben) với các ưu điểm sau: - Thời gian phân tích được rút ngắn xuống còn 18 phút khi phân tích đồng thời 5 paraben. So với các đề tài định lượng đồng thời 4 paraben (MP, EP, PP, BP) với thời gian phân tích thường từ 25 đến 30 phút(1). - Chế độ rửa giải đẳng dòng, sử dụng hệ dung môi đơn giản bao gồm acetonitril và nước acid acetic pH 3. Trong số các công trình định lượng đồng thời các chất bảo quản nhóm paraben đã công bố, có tác giả đã sử dụng pha động có đệm phosphat(1) nên cần tăng thời gian rửa hệ thống sắc ký, cần chuyển đổi cẩn thận giữa các kênh dung môi để tránh gây kết tủa muối trong hệ thống, gây ăn mòn hệ thống sắc ký; thời gian rửa cột phải kéo dài. Mặt khác, do các loại mỹ phẩm có thành phần rất đa dạng, chất nền phức tạp nên việc thẩm định quy trình trên mẫu kem không paraben cụ thể chưa mang tính đại diện cho tất cả các mẫu kem. Các paraben được phép sử dụng như MP, EP, PP, BP có giá thành rẻ, hiệu lực diệt khuẩn cao ở hàm lượng nhỏ nên các nhà sản xuất không d{m “mạo hiểm” sử dụng paraben cấm trong các sản phẩm của họ. KẾT LUẬN Quy trình định lượng đồng thời methylparaben, ethylparaben, propylparaben, butylparaben, isobutylparaben bằng phương pháp HPLC với đầu dò PDA đã được xây dựng và thẩm định, sử dụng chương trình rửa giải đẳng dòng v| pha động không có dung dịch đệm. Quy trình đã được chứng minh có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng thấp, hiệu suất chiết cao và ổn định, đạt độ chính x{c v| độ đ ng. Quy trình đã được ứng dụng để kiểm tra các paraben trong một số chế phẩm kem bôi da đang có trên thị trường. TÀI LIỆU THAM KHẢO 2. Akhtar MJ, Khan S, Roy IM, Jafri IA (1996), “High performance liquid chromatographic determination of phenoxetol, methyl paraben, ethyl paraben, n-propyl paraben, iso-butyl paraben, n-butyl paraben and croconazole.HCl”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 14, 1609-1613. 3. Annexes of The Asean Cosmetic Directive (2016), Annex VI – List of preservatives allowed for use in cosmetic products, p. 4. 4. Asean (2005), Identification and Determination of 2-phenoxy- ethanol, methyl, ethyl, propyl, and butyl 4-hydroxybenzoate in cosmetic products by TLC and HPLC, pp. 1-10. 5. Bộ Y Tế, Cục Quản lý Dược Việt Nam (2015), Công văn số 6577/QLD-MP về việc cập nhật quy định về các chất sử dụng trong mỹ phẩm, ngày 13/04/2015. 6. Ludwig H (2007), “Validation and qualification in analytical laboratories, second edition”, pp. 144, 146. 7. Trần Công Dũng, Đặng Văn Kh{nh (2014), “Nghiên cứu xây dựng quy trình định tính và định lượng đồng thời một số chất bảo quản nhóm 4-hydroxybenzoat (paraben) trong mỹ phẩm”, Đề tài nghiên cứu khoa học của Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc, Mỹ phẩm, Thực phẩm Thừa Thiên Huế. Ngày nhận bài báo: 18/10/2017 Ngày phản biện nhận xét bài báo: 01/11/2017 Ngày bài báo được đăng: 15/03/2018