Nghiên cứu quy trình thu nhận tế bào gốc trung mô từmô mỡngười hướng đếnứng dụng trong lĩnh vực y học

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 459 NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH THU NHẬN TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ NGƯỜI HƯỚNG ĐẾN ỨNG DỤNG TRONG LĨNH VỰC Y HỌC Huỳnh Duy Thảo*, Trần Lê Bảo Hà**, Lê Thanh Hùng***, Võ Quốc Vũ*, Hoàng Kc Hương*, Thái Trúc Quỳnh*, Trần Công Toại* TÓM TẮT Đặt vấn đề: Tế bào gốc ngày nay được nghiên cứu và ứng dụng rất nhiều đặc biệt trong y học tái tạo và công nghệ mô. Do đó, để thu nhận, phân lập và ứng dụng hiệu quả cần có những quy trình hiệu quả cho tế bào gốc. Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng quy trình thu nhận, phân lập và xác định nguồn tế bào gốc trung mô từ mô mỡ người để hướng đến các ứng dụng trong y học và công nghệ mô. Phương pháp nghiên cứu: Thí nghiệm thực nghiệm mô tả. Mô mỡ người được thu nhận trong điều kiện vô trùng phòng mổ và phân lập tế bào gốc bằng hỗn hợp enzyme Collagenase-Dispase. Sau đó, tế bào được nuôi trong môi trường cơ bản để bám dính và phát triển. Các tế bào này sẽ được định danh để xác định là tế bào gốc trung mô bằng cách dựa vào khả năng bám dính trên chai nuôi, khả năng biệt hóa và sự biểu hiện của các marker cho dòng tế bào gốc trung mô. Kết quả: Quần thể tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai được đem đi định danh tế bào gốc trung mô. Đó là các tế bào bám dính vào chai nuôi, có hình thái giống với nguyên bào sợi. Các tế bào này biệt hóa được thành nguyên bào xương và tế bào mỡ trong điều kiện in vitro. Các tế bào này dương tính rất cao với các marker CD44, CD73, CD90 và CD105 và biểu hiện rất thấp các marker CD45 và HLA-DR. Kết luận: Quần thể tế bào nuôi cấy từ mô mỡ là các tế bào gốc trung mô. Từ đó, có thể ứng dụng các tế bào gốc này trong các nghiên cứu ứng dụng trong y học và công nghệ mô. Từ khóa: Tế bào gốc trung mô, mô mỡ người, sự biệt hóa, marker tế bào gốc trung mô. ABSTRACT RESEARCH PROCESS TO COLLECT MESENCHYMAL STEM CELLS FROM HUMAN ADIPOSE TISSUE TOWARDS APPLICATIONS IN THE MEDICAL FIELD Huynh Duy Thao, Tran Le Bao Ha, Le Thanh Hung, Vo Quoc Vu, Hoang Kc Huong, Thai Truc Quynh, Tran Cong Toai * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 17 - Supplement of No 1 - 2013: 459 - 466 Background: Stem cells research and use a lot especially in regenerative medicine and tissue engineering today. Therefore, to capture, isolate and performance applications need to have efficient protocol suitable for stem cell. Objectives: Set up the acquisition process, the isolation and identification of mesenchymal stem cells from human adipose tissue toward applications in medicine and tissue engineering Methods: The experiment was arranged as described experiments. Human adipose tissue were collected in a sterile operating room conditions and isolation of stem cells with a mixture of enzyme collagenase- Dispase. Then, the cells were cultured in a basic medium for cell adhesion and growth. These cells will be * Bộ môn Mô – Phôi – Di truyền, ĐH Y Khoa Phạm Ngọc Thạch ** Phòng Nghiên cứu và Ứng dụng Tế bào gốc, ĐH Khoa học Tự nhiên TP.HCM *** Khoa Răng – Hàm – Mặt, ĐH Y Dược TP.HCM Tác giả liên lạc: BS Lê Thanh Hùng, ĐT: 0918.686.151, Email: ranghammat@gmail.com Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 460 identified to determine whether mesenchymal stem cells by relying on the ability to stick on the surface of culture flask, based on their ability to differentiate into other cell lines and the expression of specific markers signal for mesenchymal stem cell lines. Results: Cell populations in the second subculture are identified mesenchymal stem cells. It is the cell adhesion to the surface of culture bottles, with morphology similar to fibroblasts. These cells differentiate into osteoblasts and adipocytes in vitro conditions. These cells highly positive for the markers CD44, CD73, CD90 and CD105 and low expression of markers CD45 and HLA-DR. Conclusion: Populations of cultured cells from the adipose tissue are mesenchymal stem cells. Since then, the possible application of stem cells in research applications in medicine and tissue engineering. Keywords: Mesenchymal stem cells, human adipose tissue, differentiation, mesenchymal stem cell markers ĐẶT VẤN ĐỀ Nghiên cứu ứng dụng tế bào gốc hiện nay đang rất phát triển và đi vào nhiều lĩnh vực nghiên cứu, từ các nghiên cứu khoa học cơ bản cho đến các ứng dụng lâm sàng trong y học. Nhiều loại tế bào gốc trong cơ thể đã được nghiên cứu và triển khai ứng dụng. Hiện tại có bốn nhóm tế bào gốc được quan tâm nghiên cứu: tế bào gốc phôi, tế bào gốc trung mô, tế bào gốc tạo máu và tế bào gốc thần kinh. Mỗi nhóm tế bào gốc có những ưu và nhược điểm riêng. Tế bào gốc phôi được thu nhận từ khối tế bào bên trong của phôi nang, có khả năng biệt hóa thành mọi loại tế bào của cơ thể nhưng vấp phải các rào cản về mặt đạo đức và luật pháp khi nghiên cứu làm cho chúng trở thành đối tượng ít được nghiên cứu mặc dù là loại tế bào gốc tiềm năng nhất. Tế bào gốc tạo máu đã được nghiên cứu và ứng dụng từ rất sớm nhưng chỉ có khả năng biệt hóa thành các dòng tế bào máu cũng như tế bào cơ trơn và nội mô, làm cho nguồn tế bào gốc này hạn chế khi tiến hành nghiên cứu. Tế bào gốc thần kinh cũng tương tự tế bào gốc tạo máu vì chỉ có khả năng biệt hóa thành các tế bào thần kinh. Do đó, chỉ còn có tế bào gốc trung mô (Mesenchymal Stem Cells – MSC) thu nhận từ mô trưởng thành như tủy xương, mô liên kết, tuyến tiêu hóa hoặc các phần phụ của thai như máu cuống rốn, cuống rốn(11) MSC là các tế bào gốc đa tiềm năng, có khả năng tự đổi mới với khả năng biệt hóa thành các tế bào thuộc dòng trung mô bao gồm nguyên bào xương, tế bào mỡ và tế bào sụn trong điều kiện in vitro và phát triển thành mô xương, mỡ và sụn trong in vivo(5,11). Do có tiềm năng biệt hóa kết hợp với việc dễ dàng phân lập và nuôi cấy làm cho các MSC trở thành nguồn tế bào gốc ứng dụng rất quan trọng trong công nghệ mô và y học tái tạo. Mặc dù các MSC có rất nhiều tiềm năng ứng dụng nhưng chúng là quần thể tế bào rất hiếm, chiếm khoảng 0.001%-0.01% của toàn bộ tế bào đơn nhân tủy xương(5,11). Do đó, MSC cần phải có một quy trình thu nhận phù hợp để phát triển in vitro trước khi có những ứng dụng(4). Trong số các nguồn mô dùng để thu nhận MSC, nổi bật nhất là mô mỡ vì đây là loại mô có các đặc điểm thuận lợi khi tiến hành thu nhận, nghiên cứu và ứng dụng: thứ nhất, việc thu nhận mô mỡ là đơn giản, ít xâm lấn nên ít gây đau đớn cho bệnh nhân so với việc thu nhận tủy xương. Thứ hai, mô mỡ có chứa các tế bào cơ trơn thành mạch, tế bào nội mô, nguyên bào sợi và đặc biệt là các MSC(3). Các MSC này dễ dàng phân lập, nuôi cấy và tăng sinh in vitro và có thể cảm ứng biệt hóa thành các tế bào của các dòng tế bào khác(1,10). Thứ bà, mô mỡ chứa các MSC với tỉ lệ khá cáo, mỗi gam mô mỡ chứa 105 MSC(6). Thứ tư, khả năng đặc biệt lưu ý của các MSC thu từ mô mỡ là tiềm năng biệt hóa của các tế bào này ít chịu ảnh hưởng của người hiến mô(7). Do đó, để có thể thu nhận và ứng dụng các MSC từ mô mỡ một cách hiệu quả nên chúng tôi tiến hành thực hiện nghiên cứu quy trình phân lập, nuôi cấy và xác định các MSC từ mô mỡ Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 461 người. Từ đó, có thể sử dụng các MSC cho các nghiên cứu tiếp theo và triển khai ứng dụng trong các liệu pháp tế bào, y học tái tạo và công nghệ mô. ĐỐI TƯỢNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Sỏi được tán với Holmium: YAG LASER 200micron: SPHINX 30, tán nát sỏi hoàn toàn. Sau đó bơm rửa sỏi với quan sát máy soi và C- Arm. Cuối cùng đánh giá tỉ lệ sạch sỏi dưới C- Arm và siêu âm. Rút kim và đặt thông mono- J vào bể thận. Đối tượng nghiên cứu Mô mỡ người được thu nhận từ việc chọc hút mỡ hoặc các mô mỡ thừa được thu nhận từ các quy trình phẫu thuật. Mẫu mô được thu nhận từ các người hiến khỏe mạnh, đồng ý hiến mô để tiến hành nghiên cứu và có các xét nghiệm âm tính với HIV, HBV, HCV và VDRL. Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm được thực hiện là phương pháp thực nghiệm mô tả Thu nhận mô mỡ Mẫu mô được thu nhận trong điều kiện vô trùng của phòng mổ. Sau đó giữ mẫu trong môi trường vận chuyển gồm: Môi trường DMEM/F12, FBS (10%), Gentamycine (50μg/ml) và nhanh chóng chuyển về phòng thí nghiệm. Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ Mô mỡ được đặt trong đĩa petri sạch và rửa với dung dịch PBS có chứa penicillin /Streptomycin. Bổ sung môi trường nuôi cơ bản (môi trường DMEM/F12, FBS (10%), Gentamycine (50μg/ml), HEPES (15 mm), NaHCO3 (14nM), Biotin (33μm), D-Panto (17 μm), penicillin (100U/ml) and streptomycin (0.1 mg/ml)) vào đĩa, loại bỏ phần mô liên kết thừa và rửa sạch máu. Cắt nhỏ mẫu mô và chuyển tất cả vào tube 50 ml có nắp đậy, bổ sung hỗn hợp enzyme Dispase-Collagenase (với tỉ lệ 3:1, v/v), mẫu mô được ủ ở nhiệt độ 370C, trong thời gian 90 phút. Sau đó, ly tâm thu nhận phần cặn lắng ở đáy chai. Bổ sung môi trường nuôi cơ bản vào tube và huyền phù phần cặn lắng ở đáy chai. Lọc phần dịch tế bào qua phễu lọc tế bào (cell strainer, BD FalconTM) với đường kính 70 μM. Quay li tâm phần dịch tế bào và thu phần cặn lắng ở đáy chai. Sau đó, bổ sung dung dịch ly giải hồng cầu để loại bỏ hồng còn lẫn tạp trong dịch tế bào, để yên trong khoảng 10 phút để loại bỏ hồng cầu. Sau đó, quay li tâm phần dịch tế bào và thu phần cặn lắng ở đáy chai. Bổ sung môi trường nuôi cơ bản và huyền phù phần cặn lắng, đánh giá mật độ tế bào bằng cách nhuộm với dung dịch Trypan blue và đếm tế bào bằng buồng đếm Neubauer. Tế bào được nuôi trong chai nuôi T-25 cm2 và ở nhiệt độ 370C và 5% CO2. Định danh tế bào gốc trung mô Theo tổ chức The International Society for Cellular Therapy đưa ra các nguyên tắc chung để xác định một loại tế bào gốc là MSC cần phải thỏa 3 điều kiện sau: thứ nhất, các MSC phải là các tế bào có khả năng bám dính khi tiến hành nuôi cấy trên bề mặt chai nuôi. Thứ hai, phải có khả năng biệt hóa thành nguyên bào xương, tế bào mỡ hoặc tế bào sụn trong điều kiện in vitro. Thứ ba, các tế bào này phải biểu hiện được các marker bề mặt như CD105, CD73 và CD90, không biểu hiện các marker như CD45, CD34, CD14 và HLA-DR(2). Dựa theo các tiêu chuẩn trên, chúng tôi đánh giá các tế bào bào nuôi cấy từ mô mỡ là các MSC. Để đánh giá khả năng bám dính và phát triển trên bề mặt chai nuôi. Quan sát tế bào dưới kính hiển vi đảo ngược và nhuộm tế bào bằng thuốc nhuộm Giemsa để quan sát hình thái và khả năng bám dính của tế bào. Để khảo sát tiềm năng biệt hóa của tế bào, tiến hành thu nhận tế bào kể từ sau lần cấy chuyền thứ hai. Các tế bào này sẽ được thử nghiệm để cảm ứng biệt hóa thành nguyên bào xương và tế bào mỡ. Quy trình biệt hóa thành nguyên bào xương Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 462 từ các tế bào gốc mô mỡ như sau: tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai được chuyển lên một chai nuôi mới và sau một ngày nuôi cấy được thay bằng môi trường cảm ứng tạo nguyên bào xương gồm DMEM/F12, 10% FBS, 10-7M Dexamethasone, 10mM/ml -Glycerol phosphate, 50ng/ml Ascorbic acid, 10ng/ml FGF9, 10-7M vitamin D2 và kháng sinh(8). Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy sẽ được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá sự thay đổi về mặt hình thái. Tiến hành nhuộm Alizarin Red (AR), Von Kossa (VK) để đánh giá khả năng tạo chất nền xương và Alkaline phosphatase (AP) để đánh giá hoạt tính enzyme đặc trưng cho tế bào xương. Ngoài ra, thực hiện phản ứng RT-PCR để khảo sát sự biểu hiện gien Osteocalcin (là một trong những gien hiện tại được sử dụng để xác định cho tế bào xương). Quy trình biệt hóa thành tế bào mỡ từ các tế bào gốc mô mỡ như sau: tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai được chuyển lên một chai nuôi mới và sau một ngày nuôi cấy được thay bằng môi trường cảm ứng tạo tế bào mỡ gồm DMEM/F12, FBS (10%), Gentamycine (50μg/ml), HEPES (15 mm), NaHCO3 (14nM), Biotin (33μm), D-Panto (17 μm), Human insulin (66 nM), Triiodo-L-thyronine (1nM), Human transferrin (10μg/ml)(9). Kết quả sau 14 ngày nuôi cấy sẽ được quan sát dưới kính hiển vi đảo ngược để đánh giá sự thay đổi về mặt hình thái. Tiến hành nhuộm Oil Red O để đánh giá sự tích tựu các giọt lipid bên trong tế bào và nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang Nile Red (là một trong các phương pháp nhuộm đặc hiệu hiện tại được sử dụng để xác định cho tế bào mỡ). KẾT QUẢ Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ Hình 1: Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ. (A) Tế bào bắt đầu tăng trưởng sau 2 ngày nuôi cấy. (B) Tế bào tăng trưởng sau 7 ngày nuôi cấy. (C) Tế bào được nhuộm với thuốc nhuộm giemsa sau 10 ngày nuôi cấy. Các tế bào sau khi phân lập từ mô mỡ bắt đầu xuất hiện và bám dính sau hai ngày nuôi cấy trong môi trường nuôi cơ bản. Các tế bào ở dạng riêng lẻ, có hình dạng thon, dài giống với hình thái của nguyên bào sợi. Những tế bào này bám dính trên đáy chai nuôi. Sau một tuần nuôi cấy, các tế bào này tăng trưởng và phát triển mạnh, tạo thành các cụm (CFU) trên chai nuôi. Sau 14 ngày nuôi cấy, các tế bào này đạt đến mật độ phù hợp để cấy chuyền (chiếm khoảng 75-80% diện tích bề mặt chai nuôi). Định danh tế bào gốc mô mỡ Dựa vào khả năng biệt hóa của tế bào gốc từ mô mỡ Biệt hóa tế bào gốc mô mỡ thành nguyên bào xương Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 463 Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tế bào bằng môi trường tạo xương, tế bào bắt đầu thay hình thái từ hình dạng thon dài giống với các nguyên bào sợi, các tế bào bắt đầu xuất hiện dạng hình thái đa diện và chế tiết chất nền xương. Trong chai nuôi xuất hiện các nốt xương là dạng kết tựu chất nền xương đặc trưng trong in vitro. Sau 14 ngày nuôi cấy, các tế bào này biểu hiện được protein của chất nền xương là Osteocalcin cũng như biểu hiện được enzyme đặc trưng là AP. Biệt hóa tế bào gốc mô mỡ thành tế bào mỡ Sau 14 ngày cảm ứng biệt hóa tế bào bằng môi trường tạo tế bào mỡ, tế bào bắt đầu thay hình thái từ hình dạng thon dài giống với các nguyên bào sợi, các tế bào bắt đầu xuất hiện dạng hình tròn, bên trong bào tương bắt đầu xuất hiện các hạt lipid nhỏ. Sau đó, bên trong bào tương tế bào các hạt lipid tiếp tục kết tựu vào nhau để tạo thành các hạt lipid lớn hơn và chiếm gần hết bào tương tế bào, nhân tế bào bị đẩy ra phía ngoại vi. Tiến hành nhuộm Oil Red O, các tế bào dương tính xuất hiện với bên trong chứa rất nhiều hạt lipid màu đỏ và nhuộm Nile Red cho thấy các hạt lipid hình thành bên trong bào tương của tế bào rất nhiều khi so sánh với tế bào đối chứng không cảm ứng biệt hóa tạo tế bào mỡ (hình 3). A B C D E Hình 2: Biệt hóa tế bào gốc từ mô mỡ thành nguyên bào xương. (A) mẫu tế bào chưa biệt hóa. (B) nhuộm VK. (C) nhuộm AP. (D). Nhuộm AR. Tất cả nhuộm đều dương tính với thuốc nhuộm (vật kính X10). (E) Thực hiện phản ứng RT-PCR với gien Osteocalcin (khung màu trắng) biểu hiện trong cả hai mẫu nghiên cứu (OST1; OST2) khi so sánh với mẫu chứng (MSC). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 464 Dựa vào khả năng biểu hiện các marker bề mặt Tế bào sau lần cấy chuyền thứ hai, sẽ được thu nhận bằng enzyme Trypsin-EDTA (0.25% - 0.02%). Sau đó, tế bào sẽ được thu nhận bằng cách quay ly tâm ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 5 phút. Tế bào sẽ được rửa 2 lần với dung dịch PBS để tinh sạch và để tách tế bào thành các tế bào đơn nhằm phục vụ cho đánh giá tế bào kỹ thuật Flow Cytometry (đếm tế bào dòng chảy). Kết quả cho thấy, quần thể tế bào khảo sát biểu hiện một số marker gồm CD105, CD73, CD90, CD45, CD34, CD14 và HLA-DR. Trong đó, các tế bào này được thực hiện phản ứng lặp lại 3 lần với kết quả cho trong bảng 1. Sự biểu hiện của các marker được thực hiện trong hình 4. Bảng 1: Kết quả khảo sát sự biểu hiện của các marker từ quần thể tế bào gốc mô mỡ STT Loại CD Lần 1 Lần 2 Lần 3 Giá trị trung bình (%) Độ lệch chuẩn (%) 1 CD73 97.70 97.33 97.44 97.49 0.19 2 CD90 99.46 99.64 99.66 99.59 0.11 3 CD105 99.36 99.31 99.24 99.30 0.06 4 CD44 99.46 99.46 99.6 99.51 0.08 5 HLA-DR 0.31 0.31 0.23 0.28 0.05 6 CD45 0.26 0.25 0.22 0.24 0.02 Hình 3: Biệt hóa tế bào gốc mô mỡ thành tế bào mỡ. (A). Tế bào đối chứng. (B). Sau 7 ngày nuôi trong môi trường biệt hóa, tế bào thay đổi hình dạng và bào tương bắt đầu tích trữ lipid. (C). Sau 14 ngày, càng nhiều tế bào chuyển dạng thành tế bào mỡ và giọt lipid kết tựu vào nhau nhiều hơn. (D). Tế bào nhuộm Oil Red, trong bào tương giọt lipid nhuộm màu đỏ của thuốc nhuộm. (E). Các giọt lipid xuất hiện đầy trong bào tương và có xu hướng kết tựu vào nhau. A E C B D Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 465 Hình 4: Kết quả nhuộm Nile Red để xác định tế bào mỡ sau khi biệt hóa. (A). Mẫu tế bào đối chứng. (B). Mẫu MSC sau khi cảm ứng biệt hóa thành tế bào mỡ, kết quả cho thấy bên trong bào tương tế bào xuất hiện rất nhiều các giọt lipid bắt màu đỏ cam, các giọt lipid này hiện diện trong hầu hết bào tương tế bào, nhân tế bào bị đẩy lệch về một phía do sự tích tựu giọt lipid. Hình 5: Kết quả phân tích marker cho quần thể tế bào gốc từ mô mỡ. Kết quả phân tích cho thấy, quần thể tế bào âm tính hoàn toàn với các marker CD45 và HLA-DR (biểu hiện dương tính không quá 2%). Tế bào dương tính hoàn toàn với các marker CD44, CD73, CD90 và CD105 (biểu hiện dương tính trên 95%). Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 17 * Phụ bản của Số 1 * 2013 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật Bệnh Viện Chợ Rẫy Năm 2012 466 KẾT LUẬN Với quần thể tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ đã phân lập và nuôi cấy sau lần cấy chuyền thứ hai. Chúng tôi đã đánh giá các chỉ tiêu để xác định cho MSC, kết quả cho thấy các tế bào nuôi cấy đều là các tế bào bám dính trên chai nuôi, có hình dạng thon dài đặc trưng cho tế bào gốc trung mô. Thứ hai, quần thể tế bào này có khả năng biệt hóa được thành 2 dòng tế bào khác nhau thuộc nguồn gốc trung mô đó là nguyên bào xương và tế bào mỡ với phương pháp xác định đáng tin cậy chứng tỏ tế bào có khả năng biệt hóa được thành các dòng tế bào khác. Thứ ba, chúng tôi đã khảo sát sự biểu hiện của các marker dùng để xác định cho quần thể MSC từ mô mỡ, kết quả cho thấy tế bào dương tính khá cao (trên 95%) với các marker được CD73, CD90 và CD105. Đây là ba marker phổ biến được chấp thuận để xác định cho các MSC. Các tế bào này biểu hiện rất thấp dưới 2% các marker CD45 và HLA-DR. Như vậy, với kết quả khảo sát khả năng bám dính, tiềm năng biệt hóa và sự biểu hiện các marker bề mặt cho thấy quần thể tế bào nuôi cấy chính là các MSC. Đây là nguồn tế bào gốc rất quan trọng và tiềm năng cho các ứng dụng lâm sàng. Tuy nhiên, để có thể ứng dụng các tế bào này một cách an toàn và hiệu quả, cần thực hiện thêm các thí nghiệm khác để khảo sát sự an toàn về mặt di truyền khi thực hiện các nghiên cứu nuôi cấy in vitro cũng như tiềm năng biệt hóa của tế bào theo thời gian nuôi cấy và số lần nhân đôi thế hệ, để từ đó có thể sử dụng các tế bào này trong các điều trị góp phần nâng cao chất lượng điều trị cho người bệnh. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Coleman SR (2006). Structural fat grafting: more than a permanent filler. Plast Reconstr Surg. 118:108S-120S. 2. Dominici M et al (2006). Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The international Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8:315-317. 3. Katz AJ, Mesenchymal cell culture: Adipose tissue. In: Atala A, Lanza R (2002) Method of Tissue Engineering. Academic Press San Diego. 4. Locke M, Windsor J, Dunbar PR (2009), Human adipose- derived stem cell: isolation, characterization and application in surgrey, ANZ Surgrey Journal, 79:235-244. 5. Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC et al (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cell. Science; 284:143-147. 6. Sen A et al (2001). Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogenous. J Cell biochem. 81:312-319. 7. Strem BM et al (2005). Multipotential differentiation of adipose tissue-derived stem cells. The Keio journal of medicine, 54:132-141. 8. Tran CT, Gargiulo C, Huynh DT, Huynh MT, Filgueira L and Strong DM (2011). Culture and differentiation of osteoblasts on coral scafford from human bone marrow mesenchymal stem cells. Cell and Tissue Banking. 12:247-261. 9. Tran CT, Huynh DT, Nguyen PT, C Gargiulo C and Phan KN, et al (2010). In vitro culture and differentiation of osteoblasts from human umbilical cord blood. Cell and Tissue Banking. 11:269-280. 10. Wolter TP, Von Heimburg D, Stoffels I et al (2005). Cryopreservation of mature human adipocytes: In vitro measurement of viability. Ann Plast Surg. 55:408-413. 11. Zuk P.A, Zhu M, Ashjian P. et al (2002), Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells, Molecular Biological Cell, 13:4279-4295.