Tìm hiểu đột biến kháng Adefovir và Lamivudine trên HBV tách chiết từ huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mãn tính

Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 287 TÌM HIỂU ĐỘT BIẾN KHÁNG ADEFOVIR VÀ LAMIVUDINE TRÊN HBV TÁCH CHIẾT TỪ HUYẾT THANH BỆNH NHÂN VIÊM GAN B MÃN TÍNH Đặng Mai Anh Tuấn1,Võ Đức Xuyên An*, Phạm Hùng Vân** TÓM TẮT Đặt vấn ñề: Hiện nay ở các quốc gia vùng châu Á nói chung và Việt Nam nói riêng, bệnh viêm gan mạn do hepatitis B virus (HBV) gây ra vẫn là căn bệnh rất phổ biến nhưng chỉ có một vài loại thuốc ñặc trị trong ñó thường ñược dùng là lamivudine (LMV), adefovir (ADV), tenofovir và entecavir. Tuy nhiên, virus HBV lại có khả năng kháng ñược các thuốc có dẫn xuất từ nucleoside này với tốc ñộ nhanh hay chậm tùy vào bản thân virus mang ñột biến giúp phục hồi khả năng sinh sản ngay dưới áp lực của thuốc. Do ñó việc quyết ñịnh loại thuốc ñặc trị cho từng trường hợp phải căn cứ vào từng loại ñột biến cụ thể của loại virus HBV tương ứng. Hiện tại Việt Nam chưa có nghiên cứu tình hình kháng thuốc virus trên thể tích mẫu lớn nhằm hiểu rõ hơn thực trạng này. Mục tiêu nghiên cứu: Thực hiện một nghiên cứu trên 894 bệnh nhân viêm gan B mãn tính ñể tìm hiểu tình hình ñột biến kháng thuốc Adefovir và Lamivudine. Đối tượng và phương pháp: Các mẫu bệnh phẩm ñược thu thập từ các bệnh viện. Thực hiện ñịnh lượng HBV DNA bằng realtime PCR trên máy iQ5 với bộ thuốc thử HBV-TQPCR do công ty Nam Khoa sản xuất sau khi ñã ly trích DNA từ mẫu bệnh phẩm bằng phương pháp Boom. Tiếp ñó thực hiện khuếch ñại vùng gen HBV polymerase rồi ñưa vào hệ thống giải trình tự tự ñộng ABI 3130xl ñể xác ñịnh ñột biến và kiểu gen HBV. Kết quả nghiên cứu: Việc ñịnh lượng HBV DNA với bộ thuốc thử HBV-TQPCR do công ty Nam Khoa sản xuất ñạt ñược ñộ tin cậy cần thiết với ngưỡng phát hiện thấp nhất 200 copies/ml (hiệu suất PCR 95%-105% có hệ số tương quan R2≥0,99). Thông qua việc giải trình tự vùng gen phiên mã ngược của HBV, chúng tôi xác ñịnh kiểu gen B, C rất phổ biến và tỷ lệ tương quan giữa chúng 3:1 cũng như xác ñịnh chính xác từng ñiểm ñột biến. Chúng tôi nhận thấy tỷ lệ HBV kháng LMV tuy cao hơn ADV nhưng vẫn ở mức thấp 4,70%. Kết luận: Lamivudine vẫn là thuốc chữa trị hiệu quả và giải trình tự gen polymerase là công cụ dễ tiếp cận ñể nâng cao hiệu quả ñiều trị. Từ khoá: HBV, kháng lamivudine, kháng adefovir. ABSTRACT SURVEILLANCE OF THE MUTATIONS RESPONSIBLE FOR ADEFOVIR AND LAMIVUDINE RESISTANCE ON THE HBV EXTRACTED FROM PATIENTS’ SERA WITH CHRONIC HEPATITIS B Dang Mai Anh Tuan, Vo Duc Xuyen An, Hoang Hieu Ngoc, Pham Hung Van * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 14 - Supplement of No 2 – 2010: 287 - 293 Background: Nowadays chronic hepatitis caused by HBV is most commonly found in Asia especially in Vietnam. There’s just some potent antiviral agent specific for HBV such as lamivudine (LMV), adefovir(ADV), tenofovir and entecavir, however, HBV could develop the resistance to these drug based on the primary and compensatory resistance mutations that recover their replication capability under drug force. It is easily to see that choosing potent drug for each case depend on what kind of mutation points is. Until now, there’s not still a research on lots of specimens for making clear this situation in VietNam yet. 1Công ty Nam Khoa, **Đại Học Y Dược TP. HCM Địa chỉ liên lạc:TS.Phạm Hùng Vân Email: phhvan.nkbiotek@gmail.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 288 Object: Carrying-out a research on 894 serum samples collected from patients with chronic hepatitis causing by HBV in order to detect the mutations related to adefovir and lamivudine resistance. Materials and method: Sera collected from patients with defined HBV chronic hepatitis. The HBV DNA load in the sera were detected by real-time PCR on iQ5 system using HBV-TQPCR kit supplied by Nam Khoa Co. after extracting DNA with BOOM method. Then targeted HBV polymerase region are amplified and sequenced on ABI 3130xl Genetic Analyzer for detecting mutation points and genotyping. Results: HBV DNA quantification detected by Nam Khoa HBV PCR TQ Plus kit yielded a limit of detection of 200 copies/ml, with good PCR efficiency 95-105% and correlation (R2 = 1.00). Base on sequencing result of the HBV reverse transcriptase region, we not only confirm genotype B, C is dominated in VietNam that produced 3:1 ratio but also detect exactly every resistance mutation points. Although lamivudine resistant HBV rate is higher than adefovir, is still at low level (4.70%). Conclusions: Up to now Lamivudine is still a useful drug and HBV polymerease gene sequencing method is an efficient, available approach to improve treatment effectively. Keywords: HBV, Lamivudine resistance, Adefovir resistance. ĐẶT VẤN ĐỀ Mặc dù cách nay hơn 40 năm Krugman và cộng sự ñã phát hiện HBV và sau ñó các nhà khoa học tiếp tục chế tạo thành công nhiều loại vaccin cùng với phát triển tốt các liệu pháp chữa trị bệnh viêm gan B nhưng theo ước tính của tổ chức y tế thế giới, trên toàn cầu 1/3 dân số thế giới ñã từng hoặc ñang nhiễm HBV với khoảng 5% dân số phát triển thành viêm gan B mãn tính – chronic hepatitis B (CHB), trong số ñó 10-40% người nhiễm HBV có nguy cơ cao bị suy giảm chức năng gan(8). Báo cáo năm 2009 của Nancy Leung cho thấy trong số bệnh nhân CHB 20-30% có nguy cơ chết sớm do biến chứng gan như xơ gan hoặc ung thư gan (Hepotocellular carcinoma HCC)(3). Trong những thập niên qua, thuốc ñặc trị ñã ñược cải tiến rất nhiều mà chủ yếu là khóa khả năng nhân bản bộ gen của virus nhưng ñến nay những thuốc này vẫn là các dẫn xuất của nucleoside nhằm ngăn chặn quá trình phiên mã ngược của HBV. Thuốc ñầu tiên ñược áp dụng thành công trong ñiều trị chính là lamivudine (LMV) – năm 1999. Nhìn chung việc ñiều trị bằng lamivudine làm giảm 3-4 log hàm lượng HBV DNA trong máu ở giai ñoạn 3 tháng ñầu tham gia liệu pháp. Hiện tượng này ñi liền với sự giảm nhanh HBeAg, sự chuyển ñảo huyết thanh sang trạng thái HBeAb dương tính và giảm lượng aminotransferase (ALT). Hạn chế của liệu pháp chỉ dùng LMV chính ở khả năng kháng thuốc của virus mà chủ yếu là do ñột biến trong vùng YMDD – vùng góp phần quan trọng trong hoạt tính polymerase của virus. Ngay sau ñó 3 năm, FDA chính thức công nhận việc ứng dụng ADV trong trị liệu viêm gan B với liều thấp khoảng 10 mg bởi ADV có khả năng bất hoạt hiệu quả hoạt tính polymerase của HBV và virus này phải mất thời gian dài hơn ñể có thể kháng ñược ADV so với LMV. Hiện nay ADV thường ñược dùng trong ñiều trị bệnh nhân viêm gan do HBV ñã kháng lamivudine. Tuy nhiên cùng với sự phát triển của các thế hệ thuốc, hiện tượng virus kháng thuốc trở thành thách thức hàng ñầu trong việc quyết ñịnh liệu pháp ñiều trị viêm gan B mãn tính. Thuốc trị viêm gan B mãn tính tạo áp lực chọn lọc virus kém nhạy thuốc do các ñột biến xảy ra trong vùng phiên mã ngược. Điều này nghĩa là theo thời gian lượng virus kháng thuốc tăng lên. Có rất nhiều cơ chế giải thích hiện tượng kháng thuốc mà chủ yếu do(12): (i) Khả năng sinh sản nhanh của virus: mức ñộ sinh sản hàng ngày của hạt virus hoàn chỉnh nằm trong dãy 1012-1013. Trong các nghiên cứu gần ñây cho thấy chu kỳ bán sinh của hạt HBV hoàn chỉnh tự do nằm trong khoảng 3-24 giờ ñồng hồ. Chu kỳ bán sinh của tế bào nhiễm HBV lên ñến 100 ngày. Vì vậy ñể trị viêm gan B mãn tính hiệu quả phải dùng liệu pháp lâu dài. (ii) Các ñột biến xảy ra liên tục trong suốt chu kỳ sinh sản của virus bởi enzyme phiên mã ngược của HBV khi tổng hợp acid nucleic có xu hướng polyme hóa sai nhưng lại thiếu khả năng sửa sai. Theo lý thuyết mỗi ngày trong cơ thể bệnh nhân, mỗi một nucleotide trong bộ gen 3.2kb của HBV ñều bị thay thế. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 289 (iii) Khả năng gắn vào vùng ñặc hiệu của thuốc giảm do ñột biến xảy ra làm thay ñổi cấu trúc vùng hoạt tính phiên mã ngược của enzyme polymerase của virus. Trong các nghiên cứu gần ñây, ñiển hình là công bố của Erwin Sablon và cộng sự(13) cho thấy theo thời gian liệu pháp dùng LMV giảm dần hiệu quả do lượng HBV mang ñột biến kháng ñược LMV ngày càng tăng bởi chúng có mang thêm các ñột biến ở các vị trí phụ giúp chúng phục hồi khả năng sinh sản nhanh(15,16,17). Do vậy việc chọn loại thuốc ñặc trị HBV dựa vào công cụ giải trình gene polymerase là cách làm dễ tiếp cận, giảm ñược những chi phí và vấn ñề phát sinh khác(13,14,15). Tại Việt Nam, xét nghiệm ñịnh lượng HBV-DNA(12) và xét nghiệm giải trình tự gene rt ñể phát hiện ñột biến kháng lamivudine ñã ñược phòng thí nghiệm NK-Biotek của công ty Nam Khoa triển khai(10,11,12). Tuy nhiên ñể ñáp ứng với nhu cầu của việc theo dõi ñiều trị bằng các thuốc kháng virus hiện hành tại Việt Nam, việc nghiên cứu và theo dõi các ñột biến kháng thuốc một cách liên tục là một việc làm rất cần thiết. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Thiết kế nghiên cứu Đây là nghiên cứu tiền cứu cắt ngang ñược thực hiện tại phòng thí nghiệm của công ty Nam Khoa. Phân tích kết quả bằng phương pháp thống kê. Đối tượng nghiên cứu Mẫu huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mãn tính ñược thu thập từ bệnh viện Nhiệt Đới, bệnh viện Triều An, bệnh viện Hoàn Mỹ ñược xác ñịnh HBV-DNA (+) bằng phương pháp PCR ñịnh lượng ñược thực hiện tại phòng RD của công ty Nam Khoa. Các phương pháp trong phòng thí nghiệm ñược thực hiện trong nghiên cứu: (i) Phương pháp ly trích HBV DNA từ mẫu bệnh phẩm: Chúng tôi dùng bộ kit thương mại DNAPREP-BOOM của công ty Nam Khoa ñể ly trích HBV DNA có trong mẫu huyết thanh. (ii) Định lượng HBV DNA: Việc ñịnh lượng số bản sao HBV DNA có trong 1 ml mẫu huyết thanh là chỉ tiêu ñánh giá mức ñộ HBV ñang hoạt ñộng trong gan bệnh nhân, gián tiếp phản ánh hiệu quả liệu pháp mà họ ñã chọn. Do vậy chúng tôi cần phải dùng phương pháp ñạt ñộ nhạy cao ñể xác ñịnh chính xác số lượng bản sao HBV DNA này. Chúng tôi dùng kit HBV-TQPCR của công ty Nam Khoa chạy trên hệ thống IQ5 của Biorad. (iii) PCR khuyếch ñại vùng gene ñích: Để thu ñược ñoạn HBV DNA ñích chứa các ñiểm ñột biến kháng lamivudine và adefovir, chúng tôi dùng bộ kit HBV lamivudine PCR của công ty Nam Khoa. (iv) Tinh sạch sản phẩm PCR: Chúng tôi tinh sạch sản phẩm khuếch ñại vùng gen HBV polymerase bằng Kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System của Promega. Với phương pháp này chúng tôi ñảm bảo ñộ tinh sạch cao của DNA mục tiêu trước khi chạy phản ứng khuếch ñại ñể giải trình tự. (v) Phương pháp ñiện di DNA: Dùng hệ thống Aligent 2100 analyzer giúp xác ñịnh nồng ñộ tương ñối HBV DNA ñích trong sản phẩm PCR thu ñược nhằm tạo thuận lợi cho bước giải trình tự tiếp theo. (vi) Giải trình tự sản phẩm PCR: Chúng tôi dùng BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kits cùng với hệ thống ABI 3130xl Gentic Analyzer ñể giải trình tự ñoạn gen HBV polymerase chứa các ñiểm ñột biến gây kháng lamivudine và adefovir. Kết quả giải trình tự ñược phân tích tiếp tục bằng phần mềm Sequencing analyis và Seqcape nhằm tìm cụ thể ñiểm ñột biến và kiểu gen của HBV. (vii) Xác ñịnh kiểu gene HBV: Thực hiện bằng cách so chuỗi với ngân hàng dữ liệu kiểu gene của HBV trên NCBI với công cụ blast serach. Các ñiểm ñột biến kháng thuốc LMV và ADV ñược khảo sát Trong phạm vi nghiên cứu này, chúng tôi chỉ quan tâm các ñiểm ñột biến kháng lamivudine và adefovir ñã ñược công bố trong các công trình nghiên cứu, ñó là: (i) Điểm ñột biến gây kháng lamivudine(2,5,9,14): I169T, V173L, L180M, A181T, T184S, M204I/V/S, Q215S. (ii) Điểm ñột biến kháng adefovir(6,7,16): L80V/I, S85A, V84M, A181V/T, V214A, Q215S. Phương pháp tìm hiểu tình hình ñột biến kháng LMV và ADV Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 290 Trước hết phân loại mẫu theo 3 hướng cơ bản sau: (i) Kiểu gen HBV, chúng tôi dùng kí hiệu: B (kiểu gen B), C (kiểu gen C), D (kiểu gen D). (ii) Nhóm thuốc bị kháng, chúng tôi chia thành 3 nhóm nhỏ: A (nhóm kháng ADV), L (nhóm kháng LMV) và AL (nhóm kháng cả ADV+LMV hay kháng kép). (iii) Phân tích dữ liệu theo giới tính bệnh nhân với M (nam giới), F (nữ giới). KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Trong giai ñoạn khảo sát từ 15/10/2008 ñến ngày 29/09/2009 chúng tôi nhận ñược lượng lớn mẫu bệnh phẩm của bệnh nhân CHB nhưng chúng tôi chỉ chọn 894 mẫu với ñầy ñủ dữ liệu từ ñịnh lượng ñến ñịnh ñột biến và xác ñịnh genotype ñể khảo sát. Các kết quả thu nhận ñược cho phép chúng tôi ñánh giá như sau: Độ nhạy của kit HBV PCR TQ Plus Mix dùng trong ñịnh lượng HBV DNA Để có thể ñịnh lượng HBV DNA chính xác cần có quy trình ly trích DNA và phản ứng realtime PCR ñạt ñộ nhạy cao. Điều này không những góp phần quan trọng cho việc ñánh giá liệu pháp ñiều trị viêm gan của bác sĩ y khoa mà trong quy trình khảo sát, căn cứ vào ñó chúng tôi quyết ñịnh có thực hiện tiếp việc xác ñịnh genotype và ñột biến kháng thuốc trong mẫu hay không. Đánh giá toàn bộ kết quả ñịnh lượng 894 mẫu, chúng tôi thấy rằng bộ kit HBV-TQPCR do công ty Nam Khoa sản xuất ñạt ñộ nhạy cao cần thiết với ngưỡng phát hiện 200 copies/ml, ngưỡng cao nhất có thể phát hiện khoảng 109 copies/ml. Các ñiểm ñột biến gây kháng lamivudine Chúng tôi khẳng ñịnh mẫu chứa HBV mang ñột biến kháng LMV nếu trong vùng gene HBV polymerase ñược khảo sát xảy ra các biến ñổi: I169T, V173L, L180M, A181T, T184S, M204I/V/S, Q215S. Trong thời gian khảo sát chúng tôi không ghi nhận ñược bất cứ trường hợp nào rơi vào 3 loại ñiểm ñột biến I169T, M204S, Q215S. Điều này cho thấy ñây là ñột biến hiếm trong nhóm khảo sát của chúng tôi. Các ñiểm ñột biến kháng lamividine (LMV) phát hiện ñược tổng kết trong bảng 1. Bảng 1: Các ñiểm ñột biến kháng LMV phát hiện ñược Kiểu ñột biến V173L L180M T184S M204V M204I Mã bình thường GTG YTG ACT ATG ATG Mã ñột biến TTG ATG AGT GTG ATT/ ATC Các ñiểm ñột biến gây kháng adefovir HBV ñược khẳng ñịnh có khả năng kháng adefovir khi trong vùng gene polymerase của chúng xảy ra các biến ñổi: L80V/I, S85A, V84M, A181V/T, V214A, Q215S. Chúng tôi ghi nhận các kiểu ñột biến kháng adefovir (ADV) khảo sát ñược trong bảng 2. Bảng 1: Các ñiểm ñột biến kháng ADV phát hiện ñược Kiểu ñột biến L80V L80I S85A V84M A181V A181T V214A Mã bình thường YTA YTA TCT GTG GCT GCT GTA Mã ñột biến GTA ATA/ ATT GCG/ GCT ATG GTT ACT GCA Tỷ lệ HBV mang ñột biến kháng lamivudine và adefovir của bệnh nhân viêm gan B mãn tính Qua quá trình khảo sát, chúng tôi phát hiện 83 bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn tính (CHB) bị kháng thuốc chiếm tỷ lệ 9,28% trong tổng số 894 người; trong số ñó, 4 người kháng ADV (0,45%), Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 291 42 người kháng LMV (4,70%) và 37 người có ñột biến kháng kép (kháng cả LMV và ADV) (4,14%). Qua ñó có thể thấy mức ñộ kháng kép cao hơn kháng ADV nhưng thấp hơn kháng LMV bởi vì mức ñộ ñột biến ñiểm tại 181, 80, 84 và 85 thường xảy ra cùng với 204. Hiện tượng này giúp virus có thể tiếp tục tồn tại và sinh sản ñược dưới tác ñộng của thuốc ñặc trị. Số liệu này cũng phù hợp với thực tế tại Việt Nam do chi phí LMV rẻ hơn gần 10 lần so với ADV nên trong ñiều trị viêm gan B, LMV ñược sử dụng trước tiên. Điều này khiến LMV trở thành tác nhân chọn lọc trước với thời gian nhiều năm. Khi LMV bị kháng, ADV mới ñược sử dụng. Kết quả này cũng cho thấy mức ñộ kháng thuốc lamivudine, adefovir chiếm chưa tới 1/10 lượng bệnh nhân viêm gan mãn tính. Điều này có nghĩa là thuốc lamivudine vẫn còn là loại thuốc rất hữu dụng trong ñiều trị viêm gan B. Thống kê các kết quả ghi nhận, chúng tôi xin trình bày tỷ lệ phần trăm từng ñiểm ñột biến trong nhóm 83 bệnh nhân viêm gan siêu vi B mạn tính ñược phát hiện có ñột biến kháng thuốc trong biểu ñồ 1. Qua ñó có thể thấy ñột biến ñiểm L180, M204, L80 chiếm ña số. Điểm S85, A181 và các ñiểm khác chiếm tỷ lệ không cao nhưng cần chú ý bởi vì khi xuất hiện cùng với ñột biến gây kháng thuốc, chúng giúp cho HBV kháng thuốc phục hồi khả năng sinh sản, chẳng hạn ñột biến L80. Biểu ñồ 1: Tỷ lệ của các loại ñột biến ñiểm gây kháng LMV và ADV trong 83 mẫu ñược phát hiện có ñột biến. Tỷ lệ của các dạng ñột biến HBV kháng thuốc và sinh sản ñược dưới tác ñộng của ADV và LMV là do mang ñột biến ñơn lẻ hoặc ña ñột biến. Các ñột biến ñơn: ñược phát hiện gồm các kiểu: A181T/V, L80I, S85A, L180M, V173L, M204I/V; chiếm tỷ lệ 28,92% gồm kháng LMV (18,07%), kháng ADV (4,82%) và dạng kháng kép là ñột biến ñơn nhưng có thể gây kháng cả hai thuốc LMV và ADV (6,02%). Rõ ràng mức ñộ kháng LMV vẫn cao nhất trong ñó ñiểm M204 chiếm 13/24 mẫu và ADV thấp nhất chiếm 4/24 mẫu. Các ña ñột biến: Trong số 83 mẫu bệnh phẩm CHB ñược phát hiện có ñột biến kháng thuốc, ña ñột biến hay ñột biến kháng thuốc ña ñiểm chiếm tỷ lệ 71,08% trong ñó kháng LMV chiếm 32,53% và kháng kép chiếm 38,55%. Chúng tôi thấy tỷ lệ ñột biến ñơn/ña ñột biến là khoảng 2/5 nghĩa là rõ ràng nhờ vào các ñột biến phụ giúp phục hồi khả năng sinh sản mà lượng HBV kháng thuốc ngày càng tăng. Sự tương quan kiểu gen HBV Trong nhóm 894 mẫu khảo sát, chúng tôi quan sát thấy có 3 kiểu gen B, C và D. Tuy nhiên kiểu gen D chỉ có duy nhất 1 mẫu chiếm 0.11%, còn lại là kiểu gen B với 678 mẫu và kiểu gen C với 215 mẫu tương ứng với tỷ lệ 75.84% và 24.05% nghĩa là tỷ lệ giữa kiểu gen C/B là khoảng 1/3. Tỷ lệ này thống nhất với nghiên cứu của Ruel T. Garcia và cộng sự(4) trên bệnh nhân CHB người Việt tại Bắc California từ 6/2005 ñến 6/2008. Có thể thấy ñây có lẽ là tỷ lệ ñặc trưng của người Việt Nam bị CHB; tuy nhiên, ñể khẳng ñịnh chắc chắn ñiều này cần thêm nhiều nghiên cứu ñược công nhận khác nữa. Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 292 Sự tương quan giới tính trong nhóm bệnh nhân CHB Trong chuỗi lây nhiễm của HBV, quan hệ tình dục là một trong những con ñường chính yếu. Do ñó theo chúng tôi, nên việc ñưa thêm yếu tố giới tính vào quá trình khảo sát. Chúng tôi nhận thấy trong 894 bệnh nhân CHB tỷ lệ bệnh nhân nữ/nam là khoảng 3/4. Sự tương quan ñột biến kháng thuốc, kiểu gen theo giới tính Để có thể hình dung chi tiết về tình hình ñột biến kháng thuốc ADV và LMV của bệnh nhân bị viêm gan siêu vi B mạn tính, chúng tôi dùng cách phối 3 tiêu chí cơ bản ñó với nhau ñể có các thông số mô tả chi tiết trong biểu ñồ 2. Qua những khảo sát trên có thể thấy rất rõ ràng: (i) Mức ñộ kháng LMV cao nhất và ADV thấp nhất. (ii) Mức ñộ kháng thuốc ở kiểu gen B cao hơn kiểu gen C. (iii) Mức ñộ bệnh nhân nam bị viêm gan mãn tính cao hơn nữ. (iv) Mức ñộ bệnh nhân nam kháng thuốc cao hơn nữ. Biểu ñồ 2: Mối tương quan giữa giới tính bệnh nhân CHB khi xét theo kiểu kháng thuốc và kiểu gen của HBV Bảng 3 trình bày tỷ lệ các ñột biến phát hiện ñược với kiểu gen và giới tính trên tất cả các mẫu khảo sát. Bảng 3: Mối tương quan giữa ñiểm ñột biến với kiểu gen và giới tính bệnh nhân bị viêm gan siêu vi B mạn tính Giới/kiểu gen HBV L80 V84M S85A A181 V214 Nam/B 2,01% 0,00% 0,11% 0,11% 0,11% Nam/C 0,45% 0,00% 0,22% 0,45% 0,00% Nữ/B 0,45% 0,00% 0,00% 0,11% 0,00% Nữ/C 0,22% 0,22% 0,00% 0,34% 0,00% Giới/kiểu gen HBV V173 L180 T184 M204 Nam/B 0,11% 2,80% 0,00% 4,70% Nam/C 0,00% 0,78% 0,00% 1,01% Nữ/B 0,22% 0,56% 0,11% 1,45% Nữ/C 0,11% 0,45% 0,11% 0,67% KẾT LUẬN Hiện tại chưa có nghiên cứu cụ thể nào khẳng ñịnh mối liên quan giữa kiểu gene và mức ñộ kháng thuốc của HBV nhưng qua khảo sát 894 mẫu chúng tôi thống nhất với nghiên cứu khác về mức ñộ tương quan kiểu gen B và C ở người Việt Nam (3:1) và mức ñộ HBV kháng thuốc kiểu gen B cao Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 14 * Phụ bản của Số 2 * 2010 Nghiên cứu Y học Hội nghị Khoa học Kỹ thuật Viện Y Tế Công Cộng năm 2009 - 2010 293 hơn kiểu gen C. Thông qua việc giải trình tự ñoạn gen HBV polymerase của 894 mẫu huyết thanh bệnh nhân viêm gan B mãn tính, chúng tôi nhận thấy lamivudine là thuốc vẫn còn hữu dụng trong trị liệu. Bởi số bệnh nhân viêm gan mãn tính do HBV mang ñột biến kháng thuốc lamivudine, adefovir chiếm chưa tới 1/10 trong 928 người và tỷ lệ virus mang ñột biến kháng lamivudine chỉ chiếm 4,7%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Cuestas, M.L. et al (2009), Genetic diversity and variability of Hepatitis B Virus, Nova Science Publishers, Inc., New York. 2. Das, K. et al (2001), Molecular Modeling and Biochemical Characterization Reveal the Mechanism of Hepatitis B Virus Polymerase Resistance to Lamivudine (3TC) and Emtricitabine (FTC), Journal of Virology, 75(10):4771–4779 3. Leung, N. (2009), Chronic hepatitis B in Asian women of childbearing age, Hepatology International, 3(1):24-31. 4. Levitt, B.S. et al (2009), Prevalence of hepatitis B virus genotype B in Vietnamese patients, Hepatol International, 3(3):461–467. 5. Liaw, Y.F. (2002), Management of YMDD mutations during lamivudine therapy in patients with chronic hepatitis B, Journal of Gastroenterology and Hepatology, (17):S333–S337 6. Locarnini, S. (2003), Hepatitis B viral resistance: mechanisms and diagnosis, Journal of hepatology, 39:S124-32. 7. Locarnini, S. (2008), Primary resistance, multidrug resistance, and cross-resistance pathways in HBV as a consequence of treatment failure, Hepatol International, 2(2):147–151. 8. Lok1, A.S.F. et al (2007), AASLD practice guidelines chronic Hepatitis B, Wiley InterScience. 9. Perno, C.F. et al (2009), Lamivudine resistance mutations in hbv reverse transcriptase can be selected even at extremely low levels of viral replication. Antivir Ther 2009, 14 Suppl 1:A26 (abstract no. 24) 10. Phạm Hùng Vân (2009). PCR và real-time PCR - Các vấn ñề cơ bản và các áp dụng thường gặP. Nhà xuất bản y học. Việt Nam. 11. Phạm Hùng Vân và cộng sự (2007). Định genotype và phát hiện ñột biến YMDD kháng lamivudine của HBV bằng kỹ thuật giải trình tự vùng gene rt của HBV. Y học TP. Hồ Chí Minh. 11: Phụ bản số 3, 38-46 12. Phạm Hùng Vân, (2005). The complete solution using molecular biology tools for diagnotic and monitoring HBV and HCV infection. Proceedings of the 6th colloquium Asian Network for Clinical Laboratory Standardization and Harmonization (Oct 27-29/2005). VACB and University of Medicine and Pharmacy in HCMC: pp 31-36. 13. Sablon, E. et al (2007), Evolution of Primary and Compensatory Lamivudine Resistance Mutations in Chronic Hepatitis B Virus- Infected Patients during Long-Term Lamivudine Treatment, Assessed by a Line Probe Assay, Journal Of Clinical Microbiology, 45(12):3935–3941 14. Schinazi, R. F. et al (2003), YSDD: a novel mutation in HBV DNA polymerase confers clinical resistance to lamivudine, Journal of Viral Hepatitis, 10:256–265 15. Vincent S et al (2008), Hepatitis B virus escape mutants induced by antiviral therapy, Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 61(766– 768). 16. Xiong, Shelly et al (2003), The Hepatitis B Virus Polymerase Mutation rtV173L Is Selected during Lamivudine Therapy and Enhances Viral Replication In Vitro, Journal of virology, 77(21):11833–11841 17. Zoulim, F. (2006), Mutations affecting the replication capacity of the hepatitis B virus, Journal of Viral Hepatitis, 2006, 13:427–434 18. Zoulim, F. (2009), Mechanisms Of Hepatitis B Virus Drug Resistance, Gazeta Meùdica da Bahia, 79 (2):41-42 19. Zoulim, F. et al (2004), Evolution of hepatitis B viral load and viral genome sequence during adefovir dipivoxil therapy, Journal of Viral Hepatitis,11:74-83