Giá trị các mẫu bệnh phẩm và mật độ vi rút trong chẩn đoán và tiên lượng bệnh tay chân miệng

Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 94 GIÁ TRỊ CÁC MẪU BỆNH PHẨM VÀ MẬT ĐỘ VI RÚT TRONG CHẨN ĐOÁN VÀ TIÊN LƯỢNG BỆNH TAY CHÂN MIỆNG Tăng Chí Thượng*, Nguyễn Thanh Hùng*, Lê Quốc Thịnh*, Trương Hữu Khanh*, Đỗ Văn Niệm*, Lê Anh Tuấn*, Nguyễn Thị Ngọc Dung*, Nguyễn Ngọc Hạnh* TÓM TẮT Mục tiêu: 1) So sánh tỉ lệ dương tính với EV, EV71 ở các mẫu bệnh phẩm: phết họng, phết bóng nước (PBN), phết trực tràng (PTT) và dịch não tủy (DNT); 2) Phân tích sự thay đổi tỉ lệ EV71/EV theo tháng nhằm tìm hiểu mối tương quan giữa tỉ lệ nhiễm EV71 với dịch BTCM; 3) Phân tích tương quan giữa nồng độ vi rút (NĐVR) trong các mẫu bệnh phẩm với biến chứng. Phương pháp: Nghiên cứu thực hiện phản ứng RT-PCR và Real-time RT-PCR trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm như phết họng, phết trực tràng và dịch não tủy ở bệnh nhân có biểu hiện lâm sàng bệnh tay chân miệng, theo qui trình chuẩn và đoạn mồi do Viện nghiên cứu sức khỏe quốc gia Đài Loan – Trung Quốc cung cấp. Kết quả: Phản ứng có độ lập lại tốt và độ chính xác cao. Mật độ vi rút trong bệnh phẩm có tương quan tuyến tính nằm trong giới hạn từ 102-105copies/ml. Trong các loại bệnh phẩm, mẫu phết họng có tỉ lệ dương tính cao nhất (84,5%), kế đến là phết trực tràng (55,2%) và dịch não tủy (40,2%). Phân tích giá trị trung bình của mật độ vi rút trong các mẫu phết họng, phết trực tràng và dịch não tủy cho thấy không có sự khác biệt giữa 2 nhóm có và không có biến chứng. Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo các mốc thời gian trong năm có liên quan không rõ với cao điểm của BTCM trong năm và không tương quan với tỉ lệ biến chứng. Kết luận: Qui trình chẩn đoán EV71 3 bước đã thiết lập có khả năng phát hiện EV và EV71 cao với tỉ lệ tương ứng là 84,5% và 36,7% trên mẫu bệnh phẩm phết họng. Đây là mẫu bệnh phẩm có tỉ lệ dương tính cao nhất, lấy mẫu đơn giản nên có thể áp dụng thường qui trên lâm sàng. Chưa thấy mối tương quan rõ giữa NĐVR với khả năng gây biến chứng của EV71 và chưa xác định được sự tương quan giữa sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV với những cao điểm của BTCM. Từ khóa: enterovirus 71, bệnh tay chân miệng, Real-time RT-PCR. ABSTRACT THE VALUE OF SPECIMENS AND VIRAL LOAD IN DIAGNOSIS AND PROGNOSIS OF HAND- FOOT-MOUTH DISEASE Tang Chi Thuong, Nguyen Thanh Hung, Le Quoc Thinh, Truong Huu Khanh, Do Van Niem, Le Anh Tuan, Nguyen Thi Ngoc Dung, Nguyen Ngoc Hanh * Y Hoc TP. Ho Chi Minh * Vol. 15 - Supplement of No 3 - 2011: 94 - 101 Study objectives: 1) Determine EV and EV71- positive rates in various specimens: pharyngeal swab, vesicle swab, rectal swab abd cerebrospinal fluid; 2) Determine the correlation between EV71 infection and HFMD outbreak based on the the increased proportion of EV71 infections among all EV infections; 3) Analyze the correlation between virus load and the occurance of complications. Method: Detection EV71-RNA directed from clinical samples as pharyngeal swab, rectal swab and CSF in patients with HFMD by RT-PCR and Real-time RT-PCR, following standard protocol and primer of Taiwan National Health Research Institute. * Bệnh viện Nhi Đồng 1 Tác giả liên lạc: ThS.BS Lê Quốc Thịnh ĐT: 0903645557 Email: thinhlequoc@yahoo.com Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 95 Results: the test has been proved with good iterativeness and high accuracy. Virus load has linear correlation in range 102-105 copies/ml. The means of virus load in pharyngeal swab, rectal swab and CSF are not statistically different between non-complication and complicated group. The increase of EV71 infection proportion among all EV infections by time is unclearly related with HFMD outbreaks annually and not related with the occurance of complications. Conclusions: the three-step diagnosis process for EV71 has been proved valid to detect EV and EV71 infections with the positive rate of 84.5% and 36.7% respectively in pharyngeal swab. Pharyngeal swab is the specimen with highest positive rate and easy to take so it is applicable routinely in clinical setting. The correlation between virus load and EV71-induced complications is not clear and it is the same with the correlation between the increase of EV71 infections among all EV infections with the outbreak of HFMD. Key words: enterovirus 71, hand-foot-mouth disease, Real-time RT-PCR. ĐẶT VẤN ĐỀ Enteroviruses (EVs) là một giống thuộc họ Picornaviridae. Đây là những vi rút có một chuỗi đơn RNA chia thành 68 týp huyết thanh, gồm các nhóm echoviruses, coxsackie virus, polioviruses, và các enterovirus (EV) từ týp huyết thanh 68 đến 71(3). Trong đó coxackie A16 (CA16) và enterovirus 71 (EV71) là hai tác nhân chính gây bệnh tay chân miệng (BTCM) ở trẻ em(5,7). BTCM do EV71 có thể gây biến chứng nguy hiểm như viêm thân não, viêm cơ tim, phù phổi cấp; diễn tiến bệnh nặng rất nhanh và tử vong cao. Từ năm 2002 – 2003, tại Bệnh Viện Nhi Đồng 1 (BVNĐ1) đã phát hiện nhiều ca viêm não tối cấp, gây tử vong rất nhanh ở trẻ nhỏ hơn 3 tuổi có liên quan đến BTCM(13,4).Qua nghiên cứu tại BVNĐ1 phối hợp với Viện Pasteur TP. Hồ Chí Minh (TP.HCM), lần đầu tiên đã phân lập được EV71 trong phân trẻ BTCM có biến chứng viêm não tại Việt nam vào ngày 04 tháng 8 năm 2003(4). Số ca mắc BTCM gia tăng hàng năm, với trên vài nghìn trường hợp nhập viện mỗi năm. Nghiên cứu về tác nhân BTCM phối hợp giữa BVNĐ1 và Viện Pasteur TP.HCM năm 2005 bằng phương pháp nuôi cấy đã xác định được 2 tác nhân chính là CA16 và EV71, trong đó EV71 chiếm tỉ lệ 46%(9). Phương pháp nuôi cấy vi rút cần 1-2 tuần để thực hiện, với chi phí cao nên chỉ thực hiện trong nghiên cứu và ít có giá trị ứng dụng trên lâm sàng, khả năng dự báo dịch chậm. Những nghiên cứu gần đây cho thấy khả năng chẩn đoán với độ chính xác cao của phương pháp khuếch đại chuỗi gen (Polymerase Chain Reation: PCR) trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm khi so sánh với phương pháp nuôi cấy(1,8,10,11,12). Nghiên cứu này được thực hiện nhằm đánh giá khả năng chẩn đoán của phương pháp PCR trực tiếp từ các mẫu bệnh phẩm, giúp chẩn đoán nhanh góp phần dự báo dịch và xác định mối tương quan giữa nồng độ vi rút với biến chứng. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU So sánh tỉ lệ dương tính với EV, EV71 ở các mẫu bệnh phẩm: phết họng, phết bóng nước (PBN), phết trực tràng (PTT) và dịch não tủy (DNT). Phân tích sự thay đổi tỉ lệ EV71/EV theo tháng nhằm tìm hiểu mối tương quan giữa tỉ lệ nhiễm EV71 với dịch BTCM. Phân tích tương quan giữa nồng độ vi rút (NĐVR) trong các mẫu bệnh phẩm với biến chứng. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Bệnh phẩm Các mẫu bệnh phẩm DNT, phết họng, PTT lấy ở ngày thứ 2-4 của bệnh, được tách chiết theo qui trình, lưu giữ ở nhiệt độ âm 70OC cho tới khi thực hiện phản ứng. Hệ thống chuẩn và chứng dương Hệ thống chuẩn dựa vào chuẩn gốc do Viện Nghiên Cứu Sức Khỏe Quốc Gia Đài Loan- Trung Quốc (National Health Research Institute: NHRI) cung cấp dưới dạng dung dịch có nồng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 96 độ 1010 copies/ml. Dùng chuẩn này pha loãng thành các nồng độ chuẩn cho phép định lượng EVs-RNA và làm chứng dương cho phản ứng Revere transcriptase PCR (RT-PCR) định tính. Để có mẫu chuẩn, chúng tôi dùng bệnh phẩm có phản ứng PCR dương tính mạnh với EV (băng điện di sáng và rõ nét) trộn lẫn với nhau (khoảng 5ml) và bảo quản ở -70oC. Sau đó ly trích RNA-EV trong bệnh phẩm theo phương pháp Boom (QIAmpMinElute Virus Kit), phân chia RNA đã ly trích được thành nhiều tube 30 l, lưu giữ ở -70oC. Lấy một tube chạy RealTime- PCR với chứng gốc pha loãng và tìm được nồng độ của mẫu chuẩn. Pha loãng các mẫu chuẩn và chọn các độ pha loãng có nồng độ tương ứng từ 102 đến 107 copies/ml làm các nồng độ chuẩn để thực hiện gam chuẩn và chứng dương cho phản ứng Realtime-PCR. Ly trích EVs-RNA Dựa trên nguyên tắc trong điều kiện biến tính cao khi nhiệt độ được nâng lên, dưới tác động của QIAGEN Protease và dung dịch đệm AL cùng với sự bất hoạt của men RNAse sẽ làm màng tế bào vi rút bị phá vỡ để phóng thích RNA. Các RNA sẽ gắn kết tối đa vào màng silica khi cho thêm ethanol vào phản ứng. Các protein và các chất khác (làm ức chế các phản ứng men trong chuỗi phản ứng PCR) không bám được trên màng silica và sẽ bị loại bỏ sau khi rửa và ly tâm hai lần. Cuối cùng RNA tinh sạch sẽ được thu giữ bằng dung dịch đệm thích hợp. Cách thực hiện Cho vào 1 tube Eppendorf nắp khóa 1,5ml: 200 l bệnh phẩm, 25 l Protease, 200 l dung dịch đệm AL (chứa RNA carrier). Vortex kỹ trong 15 giây, sau đó ủ ở 56OC trong 15 phút. Ly tâm nhẹ, cho thêm vào 250 l ethanol nồng độ từ 96-100%. Vortex kỹ trong 15 giây, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút. Ly tâm nhẹ, chuyển tất cả dung dịch vào MinElute Column (QIAgen), ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Chuyển qua tube thứ 2, cho thêm vào 500 l AW1, ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Chuyển qua tube thứ 3, cho thêm vào 500 l AW2, ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Chuyển qua tube thứ 4, cho thêm vào 500 l ethanol (96-100%), ly tâm 8.000 rpm trong 1 phút. Chuyển qua tube thứ 5, ly tâm 14.000 rpm trong 3 phút. Sau đó chuyển MinElute Column qua một tube Eppendorf 1.5ml mới, mở nắp và ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 5 phút. Thêm 30 l AE (nước cất không có RNAse), ủ ở nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 10 phút. Sau đó ly tâm 14.000 rpm trong 1 phút, cẩn thận hút 30 l vào tube Eppendorf 1.5ml mới. Dùng 10 l dung dịch nổi này cho phản ứng Realtime-PCR. Chứng âm Sử dụng môi trường vận chuyển làm chứng âm ly trích và dung dịch TE1X làm chứng âm cho phản ứng Realtime-PCR. Định tính EV-RNA và EV71-RNA bằng kỹ thuật RT-PCR Hai cặp mồi đặc hiệu cho EV (EV-F và EV-R) và EV71 (F-primer1705 và R-primer 2036) được thiết kế nằm trong vùng VP1 của EV và EV71 genome cho sản phẩm khuếch đại theo thứ tự lần lượt là 148bp và 331bp do NHRI cung cấp. Trình tự các đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu cụ thể như sau: EV-F: 5'-CCCCTGAATGCGGCTAATC-3' EV-R: 5'-GATTGTCACCATAAGCAGC-3' F-primer1705: 5'- GTGGCAGATGTGATTGAGAG-3' R-primer 2036: 5'- GTTATGTCTATGTCCCAGTT-3' Sử dụng cặp mồi EV-F và EV-R trong phản ứng RT-PCR đầu tiên bằng bộ thuốc thử One- Step RT-PCT (Qiagen, USA). Phương pháp khuếch đại định tính EV được thực hiện trong những tube PCR 0.2ml với thể tích dung dịch 25µl chứa 5µl MgCl2, 1µl EV-R, 1µl EV-F, 1µl enzymes, 5µl RNA ly trích. Phản ứng RT-PCR sẽ được thực hiện trên máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự các bước như sau 50oC/30 giây trong một chu kỳ, 95oC/5 phút trong một chu kỳ; tiếp theo là 40 chu kỳ với Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 97 94oC/30 giây, 58oC/30 giây, 72oC/01 phút; và cuối cùng là 72oC/10 phút trong một chu kỳ. Sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan sát dưới ánh sáng UV sau khi điện di trên thạch 1,5% được chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X TBE. Các mẫu dương tính sẽ được thực hiện tiếp phản ứng RT-PCR với cặp mồi F-primer 1705 và R- primer 2036 trên máy luân nhiệt Genius (Techne, England) với trình tự các bước như sau 50oC/30 giây trong một chu kỳ, 95oC/5phút trong một chu kỳ; tiếp theo là 40 chu kỳ với 94oC/30 giây, 50oC/30 giây, 72oC/01 phút; và cuối cùng là 72oC/10 phút trong một chu kỳ. Tương tự như trên, sản phẩm khuếch đại PCR sẽ được quan sát dưới ánh sáng UV sau khi điện di trên thạch 1,5% được chuẩn bị với dung dịch đệm 0.5X TBE. Mỗi lần thực hiện phản ứng RT-PCR đều chạy kèm theo một chứng dương và hai chứng âm (một chứng âm ly trích và một chứng âm phản ứng PCR). Định lượng EV71-RNA bằng kỹ thuật REAL-TIME PCR với đoạn dò TAQMAN Thử nghiệm Realtime-PCR được phân tích trên máy LightCyler (Roche Diagnostics). Bộ thuốc thử LightCycler RNA Amplification Kit Hybprobe (Roche Diagnostics) đã được sử dụng trong phản ứng này. Đây là bộ thuốc thử cho phép sử dụng một bước Realtime-PCR trên ống mao quản 10µl có chứa 0.4µl MgCl2, 0.5µl EV-F, 0.5µl EV-R, 0.1µl TaqMan Hybprobe, 0.2 µl enzymes, 2 µl RNA ly trích. Phản ứng Realtime- PCR được thực hiện với các bước sau: 55oC/20 phút trong một chu kỳ, 95oC/30 giây trong một chu kỳ; tiếp theo là 45 chu kỳ với 95oC/5 giây, 57oC/15 giây, 72oC/6 giây; và cuối cùng là 40oC/30 giây trong một chu kỳ. Để tiêu chuẩn hóa phản ứng, mỗi lần thực hiện Realtime-PCR EV71 đều kèm theo bốn nồng độ chuẩn có nồng độ từ 102 đến 105 cùng một chứng âm là TE1X. Phân tích dữ liệu nhờ vào phần mềm của hệ thống máy LightCycler 1.5 (Roche Diagnostics). Dữ liệu được thu nhận ở giai đoạn bắt cặp và kéo dài (57oC) của mỗi chu kỳ; và chu kỳ ngưỡng (threshold cycle) của các mẫu thử được xác định tại điểm mà ánh sáng huỳnh quang phát ra vượt quá giới hạn nền. Đường cong chuẩn được vẽ tự động dựa vào các giá trị Ct của mỗi một nồng độ chuẩn đã biết. Hệ số tương quan của mỗi lần chạy Realtime-PCR phải đạt trên 0.98 và hiệu suất PCR từ 90 đến 100%. Số bản copies của RNA trong mẫu thử được tính dựa vào phép nội suy từ đường cong chuẩn. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Chuẩn hóa qui trình xét nghiệm Real- time RT-PCR Qui trình chẩn đoán EV71 ba bước gồm 2 phản ứng RT-PCR kết hợp với 1 phản ứng Real- time PCR đã được nghiên cứu chứng minh về độ nhạy cảm và độ đặc hiệu. Chúng tôi chỉ áp dụng qui trình được chuyển giao từ NHRI nên không cần thiết lập lại các bước xác định độ nhạy cảm và độ đặc hiệu của phản ứng, mà chỉ thực hiện chuẩn hóa xét nghiệm trong điều kiện cụ thể của phòng xét nghiệm BVNĐ1 thông qua việc xác định độ lập lại của kết quả xét nghiệm và mức độ biến thiên. Với hệ thống mẫu chuẩn được thiết kế dựa trên chuẩn gốc, chúng tôi thực hiện phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes với hệ thống mẫu chuẩn pha loãng có nồng độ EV-RNA từ 102 copies cho tới 105 copies/phản ứng. Hình 1: Chu kỳ ngưỡng của hệ thống mẫu chuẩn pha loãng có nồng độ từ 102 copies cho tới 105 copies/phản Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 98 ứng trong phản ứng Realtime-PCR với Taqman probes trong định lượng EV-RNA Hình 2: Đường cong chuẩn của Real-Time PCR với Taqman Probes định lượng EV-RNA Từ kết quả phản ứng Real-time PCR dựa trên chuẩn gốc, chúng tôi thiết lập đường cong chuẩn cho phản ứng. Kết quả (hình 2) cho thấy đường cong chuẩn của phản ứng có tương quan tuyến tính khi nồng độ EV-RNA của mẫu chuẩn nằm trong giới hạn từ 102 đến 105 copies/ml. Bảng 1: Độ lập lại của Ct ứng với các nồng độ chuẩn trong 3 lần chạy liên tiếp của phản ứng Realtime- PCR Taqman Probes phát hiện và định lượng EV71 Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 105 26,24 26,50 26,79 104 30,02 30,26 30,16 103 33,39 33,66 33,76 102 37,73 37,97 37,16 Bảng 2: Dữ liệu của đường cong chuẩn với FAM- 490 (Ct) Nồng độ TB SD CV (%) 105 26,5 0,22 1 104 30,15 0,10 0,5 103 33,60 0,16 0,47 102 37,62 0,39 1,04 Để đánh giá mức độ tin cậy của phản ứng Real-time PCR thực hiện tại phòng thí nghiệm BVNĐ1, chúng tôi nghiên cứu về độ lập lại của kết quả phản ứng cho một mẫu chuẩn được thực hiện phản ứng trên nhiều ống nghiệm khác nhau trong cùng một lần chạy phản ứng, cũng như những lần thực hiện phản ứng khác nhau. Bảng 1 và 2 trình bày độ lập lại của kết quả xét nghiệm trên gam chuẩn có nồng độ vi rút thay đổi từ 102 đến 105 copies/ml. Độ lập lại của phản ứng là khả năng lập lại kết quả xét nghiệm của cùng một mẫu thử, khi phản ứng được thực hiện nhiều lần khác nhau. Bảng 3: Sự biến thiên trong một lần phản ứng của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát hiện và định lượng EV71 Mẫu số EV71-RNA (Copies/ml) Mean SD CV (%) Lần 1: 2,4 x 10 5 Lần 2: 2,4 x 10 5 Lần 3: 2,6 x 10 5 1 Lần 4: 2,3 x 10 5 2,42 x 10 5 0,11 4,5 Lân1: 8,9 x 10 3 Lần 2: 8,9 x 10 3 Lần 3: 8,9 x 10 3 2 Lần 4: 8,4 x 10 3 8,77 x 10 3 0,22 2,5 Lần 1: 7,4 x 10 7 Lần 2: 7,9 x 10 7 Lần 3: 7,4 x 10 7 3 Lần 4: 8,4 x 10 7 7,77 x 10 7 0,41 5,2 Bảng 4: Sự biến thiên giữa các lần khác nhau của phản ứng Real-Time PCR Taqman phát hiện và định lượng EV71 Mẫu số EV71-RNA (copies/ml)/ngày Mean SD CV (%) N1: 2,42 x 10 5 N2: 2,7 x 10 5 1 N3: 2,8 x 10 5 2,64 x 10 5 0,16 6,1 N1: 8,77 x 10 3 N2: 8,3 x 10 3 2 N3: 8, 1 x 10 3 8,39 x 10 3 0,28 3,34 N1: 7,77 x 10 7 N2: 8,1 x 10 7 3 N3: 7,5 x 10 7 7,79 x 10 7 0,25 3,1 Để khảo sát độ lập lại của các mẫu thử lâm sàng, chúng tôi sử dụng 3 mẫu ly trích có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 trên xét nghiệm PCR định tính, mỗi mẫu lập lại 4 lần trong cùng một lần chạy phản ứng real-time PCR, và chạy như vậy trong 3 lần khác nhau. Kết quả trong bảng 3 và 4 cho các giá trị về nồng Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 99 độ của mẫu mỗi lần lập lại trong một lần phản ứng và trong các lần chạy phản ứng khác nhau. Hình 3: Độ lập lại của 4 lần chạy của cùng một mẫu trong cùng một plate Hình 4:Hình ảnh khuếch đại của EV71-RNA trong các mẫu thử khi thực hiện Realtime-PCR Taqman Probes Phản ứng Real-time RT-PCR được xem là chính xác khi có sự tương đồng với kết quả của phản ứng RT-PCR định tính đối với EV71. Phản ứng Real-time RT-PCR sử dụng đoạn mồi EV có độ chính xác tốt bắt buộc phải dương tính nếu phản ứng RT-PCR trên mẫu thử trước đó dương tính với EV71 và ngược lại. Để nghiên cứu độ chính xác của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes phát hiện EV71, chúng tôi thực hiện phản ứng định lượng này trên 100 mẫu bệnh phẩm phết họng gồm 90 mẫu dương tính và 10 mẫu âm tính với EV/EV71 bằng phương pháp RT-PCR. Có 10 mẫu lập lại với 5 mẫu dương và 5 mẫu âm tính. Kết quả của phản ứng Realtime- PCR Taqman Probes định lượng EV71 phù hợp với phản ứng RT-PCR. Các mẫu dương lặp lại đều có chu kỳ ngưỡng gần giống nhau với hệ số biến thiên < 5% và mẫu âm thì đường biểu diễn nằm dưới ngưỡng phát hiện. Kết quả của các mẫu lâm sàng cũng có tương quan tuyến tính với hệ số góc tương tự với mẫu chuẩn (hai đường cong chuẩn trùng khớp nhau) (hình 5). Hình 5: Đường cong chuẩn của Realtime-PCR Taqman Probe định lượng EV71-RNA Kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương pháp Realtime-PCR Taqman Probes với ưu điểm sử dụng các mồi đặc hiệu và đoạn dò đặc hiệu giúp tạo ra các sản phẩm đặc hiệu sẽ làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng. Chu kỳ ngưỡng được ghi nhận khi mà tín hiệu huỳnh quang của mẫu phát ra cao hơn tín hiệu nền. Dựa trên chu kỳ ngưỡng của các chất chuẩn và số bản sao của các chuẩn đã biết mà từ đó người ta có thể định lượng được số bản sao RNA có trong mẫu bệnh phẩm(6,8,12). Hệ thống mẫu chuẩn được chúng tôi sử dụng dựa trên chuẩn gốc do NHRI cung cấp, từ đó chúng tôi có gam chuẩn với nồng độ từ 102 copies cho tới 107 copies/phản ứng. Khi thực hiện Realtime-PCR Taqman Probes, chúng tôi có kết quả phản ứng với hệ số tương quan là 1, độ cong là -3,478, hiệu suất PCR là 93,9 và phương trình Y= -3,478X + 44,151. Các giá trị chu kỳ nguỡng Ct của các chuẩn này ổn định trong các lần chạy định lượng khác nhau (CV< 10%) (bảng Nghiên cứu Y học Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 100 1), cho thấy mức độ ổn định của định lượng EV71 bằng Taqman Probes. Ngoài ra với 4 nồng độ này cách nhau 10 độ pha loãng thì chu kỳ ngưỡng của chúng đi từ chuẩn có nồng độ cao nhất cho đến nồng độ kế tiếp cách nhau 3, 3 cho đến 3,7. Điều này nói lên tính chất tuyến tính của phản ứng. Về độ lập lại của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes, kết quả các số liệu trong bảng 2 cho thấy các giá trị số lượng bản sao của các mẫu mỗi lần lặp lại trong một lần phản ứng và trong các lần chạy phản ứng khác nhau có hệ số biến thiên CV<10%, chứng tỏ không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong một lần chạy và giữa các lần chạy khác nhau, điều đó cho thấy phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes định lượng EV71-RNA có tính đồng nhất, không thay đổi trong các tube phản ứng khác nhau có cùng nồng độ mẫu thử. Về độ chính xác của phản ứng Realtime-PCR Taqman Probes, khi tiến hành thử nghiệm trên 90 mẫu phết họng dương tính và 10 mẫu phết họng âm tính với EV/EV71 bằng phương pháp RT-PCR, chúng tôi thu được các kết quả của những lần chạy Realtime-PCR này với hệ số tương quan và hiệu quả cũng như các Ct của các nồng độ chuẩn tương đối ổn định so với nghiên cứu ban đầu. Các mẫu phết họng dương tính có Ct chạy từ 20 đến 40, với các mẫu có Ct xuất hiện sớm (trước chu kỳ 15), chúng tôi sẽ tiến hành pha loãng mẫu EV-RNA đã được ly trích, sau đó kết quả sẽ nhân với hệ số pha loãng. Các chứng âm và mẫu âm có đường biểu diễn nằm dưới ngưỡng phát hiện phù hợp với kết quả âm tính với EV bằng phương pháp RT-PCR. Thực hiện xét nghiệm PCR trên các mẫu bệnh phẩm Sau 12 tháng chúng tôi đã chọn được 449 bệnh nhân vào khảo sát. Tất cả các bệnh nhân được lấy ít nhất 1 mẫu bệnh phẩm bao gồm phết họng, PBN, PTT, và DNT khi có biến chứng thần kinh. Tỉ lệ dương tính của các mẫu bệnh phẩm đối với EV và EV71 trình bày trong bảng 5. Mẫu phết họng có tỉ lệ dương tính cao nhất với EV cao nhất khi so sánh với mẫu phết trực tràng và dịch não tủy. Bảng 5: Kết quả xét nghiệm EV, EV71 của các mẫu bệnh phẩm Dương tính EV Dương tính EV71 Bệnh phẩm Cỡ mẫu n % n % Phết họng 439 371/439 84,5 136/371 36,7 Phết trực tràng 415 229/415 55,2 69/229 30,1 Dịch não tủy 164 66/164 40,2 11/66 6,7 Phết bóng nước 3 2/3 66,7 0 - Những mẫu có phản ứng RT-PCR dương tính với EV71 sẽ được thử nghiệm Real-time RT- PCR để xác định NĐVR. Phân tích trị số trung bình của NĐVR giữa hai nhóm có và không có biến chứng bằng phép kiểm T dành cho 2 mẫu độc lập. Trong phân tích định chuẩn xét nghiệm ban đầu, tương quan tuyến tính chỉ xuất hiện khi NĐVR từ 102 đến 105 copies/ml. Do NĐVR tính toán khi thực hiện xét nghiệm các mẫu bệnh phẩm căn cứ vào quan hệ tuyến tính trên nên chúng tôi chỉ phân tích các trường hợp NĐVR trong ngưỡng nhằm đánh giá mối tương quan giữa NĐVR và biến chứng. Kết quả phân tích giá trị trung bình của NĐVR các trường hợp có kết quả nằm trong ngưỡng có tương quan tuyến tính từ 102-105 copies/ml cho thấy không khác biệt có ý nghĩa thống kê về giá trị trung bình giữa hai nhóm (bảng 6). Bảng 6: So sánh nồng độ vi rút giữa nhóm có biến chứng và không biến chứng Nhóm không biến chứng Nhóm có biến chứng Loại bệnh phẩm n Trung bình (copies/ml) n Trung bình (copies/ml) P Phết họng 30 4.960 ± 12.701 40 4.852 ± 11.171 0,97 Phết trực tràng 22 18.314 ± 22.419 31 11.159 ± 13.971 0,159 Dịch não tủy 3 4.083 ± 6.261 5 3.512 ± 4.705 0,887 Khi phân tích tương quan giữa NĐVR và các biến chứng nặng, giá trị trung bình của NĐVR trong mẫu phết họng ở nhóm không có biến chứng nặng là 4.892 ± 12.005 copies/ml (n=60) so với nhóm có biến chứng nặng là 4.957 ± 10.766 Y Học TP. Hồ Chí Minh * Tập 15 * Phụ bản của Số 3 * 2011 Nghiên cứu Y học Hội Nghị Khoa Học Kỹ Thuật BV Nhi Đồng 1 - Năm 2011 101 copies/ml (n=10), không khác biệt về mặt thống kê với p = 0,991. Hình 6: Tương quan giữa tỉ lệ EV71 và BTCM, biến chứng 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 04/07 05/07 06/07 07/07 08/07 09/07 10/07 11/07 12/07 01/08 02/08 03/08 0 175 350 525 700 TS BTCM Tỉ lệ EV71 T ỉ lệ biến chứng Tỉ lệ biến chứng nặng Hình 6: Tương quan giữa tỉ lệ EV71 và BTCM, biến chứng Tương tự như vậy, NĐVR trong mẫu PTT ở nhóm không biến chứng nặng là 13.616 ± 18.449 copies/ml (n=47) thấp hơn so với nhóm có biến chứng nặng là 18,147 ± 16,138 copies/ml (n=6), nhưng sự khác biệt này không ý nghĩa thống kê với p = 0,569. Như vậy, NĐVR trong mẫu phết họng và PTT không có tương quan với cả biến chứng chung và các biến chứng nặng là viêm não, phù phổi, viêm cơ tim và sốc. Phân tích mối tương quan giữa tỉ lệ bệnh nhân dương tính với EV71 trên tổng số được xác định dương tính theo tháng và tỉ lệ bệnh nhân có biến chứng cũng như có biến chứng nặng cho thấy không có tương quan thuận rõ ràng (hình 6). Tuy nhiên, những thời điểm có tỉ lệ EV71 cao thường trùng lặp với các đợt cao điểm của bệnh trong năm. KẾT LUẬN Kỹ thuật định lượng EV71 bằng phương pháp Realtime-PCR Taqman Probes trực tiếp từ mẫu bệnh phẩm có độ lập lại tốt và tính ổn định cao. Qui trình chẩn đoán 3 bước đã thiết lập có khả năng phát hiện EV và EV71 cao với tỉ lệ tương ứng là 84,5% và 36,7% trên mẫu bệnh phẩm phết họng. Đây là mẫu bệnh phẩm có tỉ lệ dương tính cao nhất, lấy mẫu đơn giản nên có thể áp dụng thường qui trên lâm sàng. NĐVR trong mẫu bệnh phẩm phết họng, PTT, DNT được lấy ở từ ngày 2-4 của bệnh chưa thấy có mối tương quan rõ ràng với khả năng gây biến chứng của EV71. Cần nghiên cứu thêm về sự thay đổi của NĐVR theo thời gian của bệnh để có đánh giá chính xác hơn. Sự gia tăng tỉ lệ EV71/EV theo thời gian tương ứng với những cao điểm của BTCM, nhưng chưa thấy tương quan rõ rệt với biến chứng. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Brown BA, Kilpatrick DR, Oberste MS, Pallansch MA (2000). Serotype-specific identification of enterovirus 71 by PCR. J. Clin. Virol.; 16: 107–12 2. Brown BA, Oberste MS, Alexander JP, Kennett ML, Pallansch MA (1999). Molecular epidemiology and evolution of enterovirus 71 strains isolated from 1970 to 1998. J. Virol.; 73: 9969–75 3. Cardosa MJ, Krishnan S, Tio PH, Perara D, Wong SC (1997). Isolation of subgenus B adenovirus during fatal outbreak of enterovirus 71-associated hand, foot and mouth disease in sicu, sarawak. The Lancet; 354:987–91. 4. Đỗ Văn Niệm và cộng sự (2005). Giám sát bệnh tay chân miệng dựa vào bệnh viện: phương pháp dự báo dịch viêm não do enterovirus 71. Y học - TP.HCM, tập 9, số 3: 66-71 5. Hand AK (2000), foot and mouth disease outbreak reported in Singapore. The Lancet; 356: 1338 6. Mckay IM, Arden KE, Nitsche A (2002). Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res.;30: 1292–305 7. McMinn PC (2002). An overview of the evolution of enterovirus 71 and its clinical and public health significance. FEMS Microbiol Rev.; 26: 91–107 8. Nijhuis M, van Maarseveen N, Schuurman R, Verkuijlen S, de Vos M, Hendriksen K, et al (2002). Rapid and sensitive routine detection of all members of the genus enterovirus in different clinical specimens by real-time PCR. J Clin Microbiol;40: 3666–70 9. Phan Van Tu, et al (2007). Epidemiologic and Virologic Investigation of Hand, Foot, and Mouth Disease, Southern Vietnam, 2005; Emerging Infectious Diseases; 13 (11): 1733-41 10. Read SJ, Mitchell JL, Fink CG (2001). LightCycler multiplex PCR for the laboratory diagnosis of common viral infections of the central nervous system. J Clin Microbiol; 39: 3056–9 11. Schmidt NJ, Lennette EH, Ho HH (1974). An apparently new enterovirus isolated from patients with disease of central nervous system. J. Infect Dis.;129: 304–9. 12. Singh S, Chow VTK, Phoon MC, Chan KP, Poh CL (2002). Direct detection of enterovirus 71 (EV71) in clinical specimens from a hand, foot and mouth disease outbreak in Singapore by reverse transcription-PCR with universal enterovirus and EV71- specific primers. J. Clin. Microbiol; 40: 2823–7 13. Trương Hữu Khanh (2005). Những kinh nghiệm bước đầu trong chẩn đoán và xử trí nhiễm enterovirus 71 ở trẻ em. Y học - TP.HCM, tập 9, số 3: 58-66